Tropismo ocular del SARS

Aug 03, 2023

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 7675 (2022) Citar este artículo

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Aunque se informan manifestaciones oculares en pacientes con COVID-19, falta consenso sobre el tropismo ocular del SARS-CoV-2. Aquí, infectamos ratones transgénicos K18-hACE2 con SARS-CoV-2 utilizando varias rutas. Observamos manifestaciones oculares e inflamación de la retina con producción de citocinas proinflamatorias en los ojos de ratones infectados por vía intranasal (IN). La infección intratraqueal (IT) provoca la diseminación del virus desde los pulmones al cerebro y los ojos a través de los nervios trigémino y óptico. Las invasiones oculares y neuronales se confirman mediante infección intracerebral (IC). En particular, el virus que se aplica en gotas oculares (DE) no causa infección pulmonar y se vuelve indetectable con el tiempo. La distribución ocular y neurotrópica del virus in vivo es evidente en las imágenes de fluorescencia con un clon infeccioso de SARS-CoV-2-mCherry. Las características oculares trópicas y neuroinvasivas del SARS-CoV-2 se confirman en hámsteres sirios de tipo salvaje. Nuestros datos pueden mejorar la comprensión sobre la transmisión viral y las características clínicas del SARS-CoV-2 y ayudar a mejorar los procedimientos de control de COVID-19.

Varios virus respiratorios, como los adenovirus de la especie D y los virus de la influenza del subtipo H7, muestran tropismo ocular y causan enfermedades oculares en humanos1. Si bien se han informado comúnmente manifestaciones y anomalías oculares en pacientes con COVID-192,3, el tropismo ocular y las patologías del SARS-CoV-2 siguen sin estar claros. No se detectó ARN viral mediante el análisis de PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) de los hisopos conjuntivales de tres pacientes con COVID-19 y conjuntivitis bilateral4 y en 16 muestras de humor acuoso y vítreo de casos post mortem5. Por el contrario, un estudio transversal realizado en Italia informó la presencia de ARN viral en los hisopos conjuntivales de 52 de 91 pacientes con COVID-19, con una alta tasa de detección en pacientes con enfermedad grave6. Otros estudios transversales en China7 y Brasil8, y exámenes post mortem9,10 también informaron la detección de ARN viral en hisopos conjuntivales o en el humor acuoso de pacientes con o sin manifestaciones oculares.

Como la superficie ocular representa una superficie mucosa adicional expuesta a aerosoles infecciosos, los ojos se consideran una posible vía de transmisión del SARS-CoV-2. De hecho, el receptor del SARS-CoV-2 se expresa en la superficie ocular humana11,12. Deng et al. demostró que el SARS-CoV-2 potencialmente entró a través de la conjuntiva en macacos rhesus después de la inoculación conjuntival13. Además, el SARS-CoV-2 puede infectar células epiteliales oculares derivadas de células madre embrionarias humanas14 y células epiteliales conjuntivales humanas15. Por lo tanto, es necesario investigar si los ojos pueden actuar como sitios de entrada de virus primarios o secundarios para guiar las estrategias preventivas o terapéuticas contra la transmisión del SARS-CoV-2.

En este trabajo evaluamos el tropismo ocular y la posible transmisión ocular del SARS-CoV-2 utilizando ratones transgénicos K18-hACE2 y hámsteres sirios de tipo salvaje. Utilizando diversas rutas de inoculación, demostramos el tropismo ocular del SARS-CoV-2 mediante la invasión neuronal de los nervios trigémino (TN) y óptico (ON) en el modelo de ratón. Utilizando clones infecciosos de SARS-CoV-2-mCherry y un sistema de imágenes de fluorescencia, examinamos la distribución ocular y neurotrópica del virus in vivo. Además, proporcionamos evidencia de las características oculares trópicas y neuroinvasivas del SARS-CoV-2 en hámsteres de tipo salvaje.

Un estudio anterior informó que la infección de los ojos por el virus Zika (ZIKV) provocó el desarrollo de conjuntivitis y panuveítis, y provocó inflamación en los tejidos uveales de un modelo de ratón16. Para investigar si la patogénesis de la enfermedad ocular se debe a la respuesta a la infección por SARS-CoV-2 en ratones K18-hACE2, infectamos ratones por vía intranasal (IN) con 104 unidades formadoras de placas (UFP) del virus o el mismo volumen. de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (grupo simulado). De acuerdo con hallazgos anteriores17, observamos una pérdida de peso del 20% a los 7 días después de la infección (dpi; Fig. 1a) y mortalidad a los 8 dpi (Fig. 1b). En particular, a 6 ppp, se produjeron lagrimeo y secreción ocular en el 25% de los ratones infectados (Fig. 1c). Luego evaluamos la presencia de SARS-CoV-2 en los ojos de ratones después de la infección IN. A los 6 ppp, se evaluó mediante un ensayo de placa la carga viral en los pulmones y los ojos, incluidos los apéndices. El título viral infeccioso obtenido de los ojos fue tan alto como el del pulmón (~106 PFU/g; Fig. 1d). Teniendo en cuenta la detección de ARN viral en lágrimas de pacientes con SARS-CoV18 y SARS-CoV-219, evaluamos las copias de ARN viral en la glándula lagrimal a 6 ppp mediante RT-qPCR dirigida al gen de la nucleocápsida viral (Fig. 1e). Curiosamente, la carga viral de la glándula lagrimal fue significativamente menor que la de los ojos y similar a la del bazo (~104 copias de ARN viral por microgramo de ARN total), uno de los tejidos que es insignificantemente susceptible a la infección20. Estos hallazgos también se confirmaron en ratones hembra K18-hACE2, lo que indica que el virus carecía de especificidad de sexo o género (Figura 1 complementaria). A continuación, examinamos las secciones de retina de ratones infectados con IN a 6 ppp para detectar la proteína de pico viral (S) mediante tinción por inmunofluorescencia. La proteína ACE2 se observó en la retina (Figura complementaria 2). La proteína S se observó principalmente en la capa de células ganglionares de la retina que consta de células ganglionares de la retina, cuyos axones forman el nervio óptico, el quiasma y el tracto (Fig. 1f). También observamos la colocalización de la proteína S y la γ-sinucleína, un marcador de las células ganglionares de la retina21, en la capa de células ganglionares, lo que indica que las células infectadas posiblemente eran células ganglionares de la retina (Figura complementaria 3). Estos resultados demostraron la presencia de SARS-CoV-2 infeccioso en los ojos, lo que sugiere que los ojos eran el objetivo de la infección por SARS-CoV-2, posiblemente a través de una invasión neuronal.

Se infectaron de forma simulada por vía intranasal ratones K18-hACE2 macho de ocho a nueve semanas de edad con 104 UFP de SARS-CoV-2 (n = 5 para ratones infectados de forma simulada y con SARS-CoV-2, respectivamente; Mock, Gris; SARS-CoV-2, Rojo). a Los cambios de peso corporal se muestran como porcentaje del peso inicial. b La supervivencia se evaluó a los ppp indicados. c Imagen representativa de lagrimeo y secreción ocular en ratones infectados con SARS-CoV-2 a 6 ppp (derecha) en comparación con los de ratones infectados simuladamente (izquierda). d La carga viral en los pulmones y los ojos, incluidos los apéndices, se analizó mediante un ensayo de placa a 6 ppp. e Los niveles de ARN viral en los pulmones, el cerebro, los ojos, incluidos los apéndices, la glándula lagrimal, la glándula parótida y el bazo se evaluaron mediante RT-qPCR a 6 ppp. Se cortaron las copias de ARN viral (104 copias/μg). Una línea discontinua indica los niveles de ARN viral del bazo como límite de detección. f Imágenes confocales representativas de secciones de retina teñidas con inmunofluorescencia de ratones infectados con IN (n = 3 por grupo) para la proteína de pico viral (S) (rojo) a 6 ppp. Se utilizó la tinción DAPI (azul) para visualizar los núcleos de la capa de células ganglionares (GCL), la capa nuclear interna (INL) y la capa nuclear externa (ONL) en la sección transversal de la retina. Barra de escala = 100 μm. Los símbolos representan medias ± SEM. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante pruebas t de dos colas múltiples (a), pruebas t de dos colas no pareadas (d) o ANOVA unidireccional (e). SARS-CoV-2: síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2; Unidad formadora de placa UFP, ARN viral vRNA, dpi días después de la infección.

Examinamos además los cambios histopatológicos e inflamatorios en respuesta a la infección utilizando secciones oculares teñidas con hematoxilina-eosina (H&E) de ratones infectados con SARS-CoV-2 IN o simulados. Como el grosor de la retina se considera una posible firma inflamatoria22, medimos el grosor de la retina después de la infección para determinar la inflamación de la retina. En comparación con lo observado en el grupo simulado, se observaron lesiones en los tejidos de la retina en los ratones infectados con SARS-CoV-2 (Fig. 2a y Fig. 4 complementaria). El grosor medio de la retina (desde la capa de células ganglionares hasta la capa nuclear externa) fue de 46,27 µm en el grupo simulado y de 75,14 µm en el grupo infectado (Fig. 2b). La infección viral aumentó significativamente el grosor de la retina en 1,62 veces, induciendo una acumulación sustancial de células inflamatorias infiltrantes en las células ganglionares y en las capas nucleares interna y externa. Para identificar las células inmunitarias infiltrantes, teñimos los ojos para detectar células T CD3+, T CD4+ y T CD8+, macrófagos/monocitos inflamatorios y neutrófilos GR1+ mediante tinción por inmunofluorescencia (Fig. 2c y Fig. 5 complementaria). Se observaron niveles más altos de células T y neutrófilos en los ojos de ratones infectados con SARS-CoV-2 a 6 ppp que en los ratones infectados de forma simulada. Además, a 6 ppp, el inmunoanálisis múltiple de los ojos, incluidos los apéndices, mostró una elevación de los niveles de citocinas y quimiocinas proinflamatorias, incluido el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), la proteína 10 inducible por interferón gamma (IP-10), MKC, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos-2 (MIP-2), interleucina (IL)-6 e IL-12, en respuesta a la infección (Fig. 3a). Los niveles de citocinas y quimiocinas proinflamatorias aumentaron significativamente en el cerebro en comparación con el pulmón, donde la carga viral era comparable a la de los ojos, incluidos los apéndices (Fig. 1e y Fig. 6 complementaria). Estos hallazgos indicaron que el SARS-CoV-2 administrado por IN promovió la inflamación de la retina y la producción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias en los ojos de ratones K18-hACE2.

una tinción H&E de secciones de ojos de ratones K18-hACE2 seis días después de una infección simulada o infección por SARS-CoV-2 (104 UFP). Imágenes histológicas representativas (n = 4 por grupo) muestran cambios en el grosor de la retina. Barra de escala = 50 μm. b El grosor de la retina (n = 4 por grupo, ocho ojos en total) se midió y se muestra en un gráfico de barras (simulado, gris; SARS-CoV-2, rojo). Los símbolos representan medias ± SEM. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante una prueba t de dos colas no apareada. c Análisis de inmunofluorescencia de tejidos oculares de ratones infectados con SARS-CoV-2 (simulacro, n = 8; SARS-CoV-2, n = 10) a 6 ppp. Las criosecciones se marcaron para Gr-1 (neutrófilos), CD3 (células T) y DAPI (núcleo). En las imágenes se muestran las diferencias en la infiltración de neutrófilos Gr-1 y células T CD3+ entre ratones infectados simuladamente y con SARS-CoV-2. Las imágenes de microscopía confocal se adquirieron utilizando un objetivo de 20 × y 40 × (con zoom de 2 ×). Barras de escala en el panel = 100 m para objetivo de 20×; 20 µm para objetivo de 40× (con zoom de 2×). Los datos fueron representativos de dos experimentos independientes. SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, capa de células ganglionares GCL, capa plexiforme interna IPL, capa nuclear interna INL, capa plexiforme externa OPL, capa nuclear externa ONL, segmentos internos IS, segmentos externos OS, dpi días posteriores infección.

a Los niveles de quimiocinas y citocinas en los ojos, incluidos los apéndices, en ratones infectados con SARS-CoV-2, se midieron mediante inmunoanálisis múltiple (n = 4 por ppp indicado; 0 ppp, gris; 3 ppp, amarillo; 6 ppp , rojo). Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos G-CSF, quimiocina 10 con motivo CXC IP-10 (CXCL10), quimiocina derivada de queratinocitos de ratón MKC, proteína quimioatrayente de monocitos MCP-1 (CCL2), proteína inflamatoria de macrófagos MIP-2-2 (CXCL2). b Foto del aparato visual del acantilado utilizado en este estudio. c, d Se midió el tiempo de latencia para desmontar la plataforma (c) y el porcentaje de ratones que dieron el primer paso sobre el acantilado (d) (simulado, n = 9; SARS-CoV-2 (normal), n = 7 ; SARS-CoV-2 (Síntomas oculares), n = 7). Los símbolos representan medias ± SEM. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante ANOVA unidireccional (a, c). SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, dpi días después de la infección.

A continuación, evaluamos las consecuencias funcionales de la inflamación de la retina en el comportamiento visual. La aversión innata a la profundidad se ha explotado en la prueba del acantilado visual diseñada para estudiar la percepción de la profundidad en ratones utilizando un aparato de acantilado visual que se muestra en la figura 3b23. El orden de las pruebas fue aleatorio y cada ratón fue evaluado sólo una vez en la vida para evitar un efecto memoria. A los 5 ppp, los ratones infectados con SARS-CoV-2 se dividieron en dos grupos según la presencia o ausencia de síntomas oculares. El mismo día, los ratones de los grupos simulados e infectados con SARS-CoV-2 desmontaron la plataforma en 4,28 y 3,56 s (media), respectivamente (Fig. 3c). Los ratones infectados por SARS-CoV-2 con síntomas oculares presentaron una latencia prolongada para el desmontaje (42,92 s). Sin embargo, el número de ratones con el primer pie en el acantilado no difirió entre los grupos simulados y los infectados con SARS-CoV-2, independientemente de los síntomas oculares (Fig. 3d), lo que indica que la inflamación de la retina inducida por la infección viral no exacerbó la retina. Degeneración o pérdida visual.

Al igual que otros virus neurotrópicos, como el ZIKV y el virus del Nilo Occidental, se ha informado que el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 causan síntomas de trastornos neurológicos en pacientes24,25. Recientemente, se detectó evidencia de rápida propagación del SARS-CoV-2 al bulbo olfatorio a través de los nervios olfatorios en pacientes con COVID-1926,27. Como tanto el nervio olfatorio como el TN proporcionan conexiones anatómicas entre el cerebro y los conductos nasales28, planteamos la hipótesis de que el SARS-CoV-2 administrado por IN se propaga al cerebro y los ojos a través del TN y el ON (Fig. 4a). Para validar esta hipótesis, infectamos ratones con SARS-CoV-2 utilizando varias rutas de inyección (Fig. 4b; IT: intratraqueal, IC: intracerebral, ED: colirio, IV: intravenosa). Se inyectó una dosis de 104 UFP a los ratones y se evaluaron las cargas virales en los pulmones, el cerebro, los globos oculares, TN y ON a 3 y 6 ppp. Se observó una pérdida de peso general en ratones inyectados por las vías IN, IT e IC. La mortalidad se observó solo en ratones inyectados por vía IC desde 2 ppp (Figura complementaria 7). Esta observación es consistente con la de un estudio anterior que demostró que la infección cerebral por SARS-CoV conduce a la muerte de ratones K18-hACE229. La inyección IN resultó en tropismo ocular con niveles elevados de ARN viral en los globos oculares entre 3 y 6 ppp (Fig. 4c). En general, los títulos de ARN viral detectados en TN y ON fueron comparables a los del cerebro y los globos oculares, lo que indica transmisión viral a los ojos y al cerebro a través de la invasión neuronal de estos nervios. También detectamos partículas virales infecciosas en TN y ON, cuyo patrón era similar al de los niveles de ARN viral (Figura complementaria 8). Para investigar más a fondo esta diseminación desde el pulmón a los ojos y al cerebro, inyectamos directamente el virus en los pulmones mediante la ruta IT. De manera similar a la infección IN, también se detectaron títulos elevados de ARN viral en los globos oculares, el cerebro, TN y ON a 6 ppp, lo que indica transmisión viral desde el pulmón a los ojos y el cerebro a través de TN y ON. Para confirmar la ruta de infección entre los ojos y el cerebro mediante TN y ON, inyectamos directamente el virus en el cerebro mediante la ruta IC. Se encontraron copias de ARN viral en los globos oculares, el cerebro, TN y ON; sin embargo, las copias del ARN viral en el pulmón eran relativamente menores que las de otros tejidos. La infección por IC evidentemente demostró que el virus puede migrar a los ojos a través del TN y ON desde el cerebro. Además, como tanto las infecciones IN como IC mostraron el título viral más alto en los ojos a 6 ppp, se encontraron lagrimeo y secreción ocular solo en ratones infectados a través de las rutas IN e IC. Estos resultados revelaron que la transmisión viral se produce entre el cerebro y los ojos a través del TN y el ON, con una red que llega al pulmón.

a Un gráfico anatómico que representa el cerebro, el ojo (nervio óptico), el nervio trigémino y el pulmón murinos. Creado con BioRender.com. b Ilustración que muestra las diversas vías de inyección: intranasal (IN), intratraqueal (IT), intracerebral (IC), colirio (ED) e intravenosa (IV). Creado con BioRender.com. c Se inocularon ratones K18-hACE2 con 104 UFP de SARS-CoV-2 mediante cinco rutas de inyección diferentes (n = 8 por ruta de inyección; n = 4 para 3 ppp y 6 ppp, respectivamente). Los niveles de ARN viral en los pulmones, el cerebro, los globos oculares, el nervio trigémino y el nervio óptico se analizaron a 3 y 6 ppp mediante RT-qPCR (3 ppp, azul; 6 ppp, rojo). Las copias de ARN viral se sometieron a un corte de 103 copias/μg. Los símbolos representan medias ± SEM. SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, unidad formadora de placa UFP; dpi: días post-infección.

La superficie ocular de los modelos humanos12,14 y murinos30, que expresa ACE2 y TMPRSS2, se considera una superficie mucosa adicional posiblemente expuesta a aerosoles que contienen virus. Para investigar si el virus puede ingresar a los ojos y migrar al tracto respiratorio, medimos la carga viral siguiendo la ruta de infección del DE (dosis de 104 UFP). La carga de ARN viral se detectó en los globos oculares a 3 ppp, pero no a 6 ppp, y se detectó una carga viral baja solo en TN y ON. Esto demostró la leve posibilidad de susceptibilidad ocular al SARS-CoV-2. Un estudio anterior sugirió que la infección por SARS-CoV-2 por vía intravenosa no era necesaria para la infección pulmonar31. De hecho, la infección intravenosa provocó copias virales relativamente bajas en todos los tejidos estudiados, que incluían los pulmones, el cerebro, los globos oculares, TN y ON. En general, el SARS-CoV-2 puede migrar desde el tracto respiratorio a los ojos a través del cerebro a través de TN y ON, lo que no se puede revertir.

La incorporación de un gen indicador fluorescente en un virus con capacidad de replicación ha mejorado nuestra capacidad para rastrear la infección viral y el tropismo in vivo. Para confirmar la propagación viral desde el tracto respiratorio hasta los ojos a través del cerebro, utilizamos un clon infeccioso, SARS-CoV-2-mCherry, generado mediante el sistema de genética inversa32. Se insertó una secuencia que codifica el marcador fluorescente mCherry en el marco después del extremo C de la proteína ORF7a para evitar la eliminación de secuencias virales. Este virus puede replicar y recapitular características de infecciones graves por COVID-19 asociadas con el modelo de ratón33. En ratones infectados por vía IN con 104 UFP de SARS-CoV-2-mCherry, se observó una morbilidad significativa a partir de 5 ppp (Fig. 5a). La mortalidad se observó desde 7 ppp hasta 9 ppp (Fig. 5b). Los ratones restantes cumplieron los criterios de valoración humanos a 9 ppp. La distribución viral en los tejidos, incluidos los pulmones, el cerebro, los globos oculares, el bazo, el TN y el ON, se analizó a 6 ppp utilizando un sistema de imágenes in vivo para detectar la fluorescencia de SARS-CoV-2-mCherry. Para detectar la fluorescencia en TN y ON de ratones sacrificados, cortamos el hueso parietal a lo largo de los lados izquierdo y derecho y la sutura sagital, seguido de la extracción del cerebro suavemente para exponer la base de la cavidad craneal (Fig. 5c). . Se detectaron fuertes señales de fluorescencia en todos los tejidos estudiados (oscilaron entre 106 y 109 de eficiencia radiante [p/seg/cm2/sr]/[μW/cm2]), que eran claramente distinguibles de las del grupo simulado, excepto en el bazo, el control negativo (Fig. 5d). La distribución viral al cerebro y los ojos validó la invasión neuronal del virus a TN y ON que puede usarse para la transmisión del SARS-CoV-2.

Se inocularon ratones K18-hACE2 con 104 UFP de SARS-CoV-2-mCherry (n = 6 para los ratones infectados y simulados, respectivamente). a, b El peso corporal (a) y la supervivencia (b) se controlaron al ppp indicado (simulado, gris; SARS-CoV-2-mCherry, rojo). Los símbolos representan medias ± SEM. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante pruebas t múltiples de dos colas. c Una vista dorsal diseccionada del cerebro de la cavidad craneal murina que muestra los nervios ópticos, el quiasma óptico, los ganglios del trigémino y las ramas del trigémino (1, oftálmica; 2, maxilar; 3, mandibular). Creado con BioRender.com. d Imágenes representativas de fluorescencia in vivo de órganos, incluidos los pulmones, el cerebro, los ojos y el bazo en ratones infectados simuladamente o con SARS-CoV-2-mCherry a 6 ppp (n = 5 para los ratones infectados y simulados, respectivamente; superior, simulado; inferior, SARS-CoV-2-mCherry) se adquirieron mediante imágenes secuenciales. Las barras de color indican la eficiencia radiante [p/seg/cm2/sr]/[μW/cm2]. SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, unidad formadora de placa UFP; dpi: días post-infección.

Como la expresión y distribución de hACE2 en ratones K18-hACE2 están bajo el control del promotor de la citoqueratina 1834, estos animales no son naturalmente sensibles a la infección por SARS-CoV-2. La investigación del tropismo ocular en hámsteres sirios de tipo salvaje, cuyo ACE2 endógeno puede interactuar con el SARS-CoV-2 para hacerlo naturalmente permisivo a la infección viral35,36,37,38, debe extrapolarse a los humanos. La inoculación IN de SARS-CoV-2 (dosis de 104 UFP) de hámsteres sirios resultó en una pérdida de peso (~10%) a los 6 ppp, aunque la mayoría de los animales volvieron a su peso original a los 14 ppp (Fig. 6a). Durante el transcurso de los experimentos, no se observó mortalidad ni en los grupos simulados ni en los de infección. Para determinar el tropismo ocular del SARS-CoV-2 en un modelo de hámster, infectamos el virus por vía IN y ED. En comparación con lo observado con la infección IN, no se observó una pérdida de peso significativa en los hámsteres infectados con ED (dosis de 104 UFP) (Fig. 6b). La cantidad de SARS-CoV-2 infeccioso en los pulmones y en los globos oculares 6 días después de la infección IN o ED se evaluó mediante un ensayo de placa. Se detectó virus infeccioso en los globos oculares en los hámsteres infectados con IN, lo que confirma el tropismo ocular del SARS-CoV-2 en animales de tipo salvaje (Fig. 6c, d). Además, el análisis del título del virus mediante RT-qPCR mostró la presencia del virus en otros tejidos de hámsteres infectados con IN, incluido el cerebro, ON y TN, con títulos más altos que los del bazo, que es insignificantemente susceptible al SARS-CoV. -2 infección (Fig. 6e). Sin embargo, se detectaron niveles de ARN viral ligeramente más altos solo en los globos oculares y en el ON de hámsteres infectados con DE que en el bazo (Fig. 6f). En consecuencia, el análisis de la patología macroscópica reveló lesiones patológicas y congestión pulmonar solo en hámsteres infectados con IN-SARS-CoV-2 a 6 ppp (Fig. 7a). También se observaron cambios histopatológicos, como engrosamiento del tabique alveolar e infiltración de células inflamatorias en los pulmones, solo en hámsteres infectados con IN-SARS-CoV-2 (Fig. 7B). Estos datos son consistentes con los hallazgos antes mencionados en ratones K18-hACE2, lo que sugiere que el SARS-CoV-2 puede propagarse desde el tracto respiratorio al cerebro y los ojos a través del TN y el ON, lo que no se puede revertir.

Los hámsteres sirios dorados hembra de once semanas de edad estaban infectados de manera simulada o infectados con 104 UFP de SARS-CoV-2 (n = 6 para ratones infectados de manera simulada y n = 5 para ratones infectados; simulacro, gris; SARS-CoV- 2, rojo). a Los cambios de peso corporal se muestran como el porcentaje del peso inicial en los ppp indicados después de la infección IN. b Los hámsteres sirios estaban infectados por IN o ED con 104 UFP de SARS-CoV-2 (cada n = 5 para infectados de forma simulada IN, infectados por IN, infectados de forma simulada con ED e infectados con ED). Se muestra un gráfico que muestra el cambio porcentual de peso corporal. c, d Las cargas virales a 6 ppp en los pulmones y ojos de hámsteres infectados con IN (c) e infectados con ED (d) se midieron mediante un ensayo de placa. e, f Los niveles de ARN viral a 6 ppp en los pulmones, el cerebro, los globos oculares, los nervios ópticos (ON), los nervios trigémino (TN) y el bazo de animales infectados con IN (e) y ED (f) se evaluaron mediante RT. -qPCR. Las copias de ARN viral se sometieron a un límite de 104 copias/μg. La línea discontinua indica los niveles de ARN viral del bazo como límite de detección. Los símbolos representan medias ± SEM. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se determinaron mediante pruebas t de dos colas múltiples (a, b), pruebas t de dos colas no pareadas (c, d) o ANOVA unidireccional (e, f). SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, unidad formadora de placa UFP, dpi días después de la infección.

Los hámsteres sirios estaban infectados por IN o ED con 104 UFP de SARS-CoV-2 (cada n = 5 para infectados de manera simulada, infectados por IN, infectados de manera simulada por ED e infectados por ED) una imagen digital representativa de pulmones extraídos de hámsteres infectados o simulados a 6 ppp. b Cortes representativos de tejido pulmonar teñidos con H&E de hámsteres infectados o simulados a 6 ppp utilizados para identificar cambios histopatológicos. Los paneles de la izquierda representan imágenes de bajo aumento (barra de escala = 500 μm). Los paneles de la derecha muestran imágenes de gran aumento de las regiones designadas por cuadrados (barra de escala = 100 μm).

Un estudio anterior destacó el neurotropismo del SARS-CoV-2 y sugirió la necesidad de identificar la ruta de invasión viral en el cerebro39. Los nervios olfatorios forman haces que proporcionan una conexión anatómica entre el cerebro y el conducto nasal a través de los agujeros de la placa cribiforme y hacen sinapsis con los glomérulos del bulbo olfatorio40. Además, las ramas V1 (oftálmica) y V2 (maxilar) del TN (Fig. 5c) inervan las regiones respiratoria y olfativa del conducto nasal, conectando el cerebro41,42. Aunque varios grupos de investigación han demostrado la infección por SARS-CoV-2 y la transmisión a través de los nervios olfatorios26,27,43, las de TN aún no se han dilucidado. A partir de datos obtenidos de un paciente con COVID-19 que padecía neuralgia del trigémino, se ha sugerido la invasión neuronal vía TN en humanos44. En este estudio, demostramos que el TN puede infectarse con el SARS-CoV-2 y usarse para transmitir el virus al cerebro y los ojos, junto con el ON.

Como el conducto nasolagrimal proporciona una conexión anatómica entre la superficie ocular y el tracto respiratorio45, la propagación del virus a los ojos podría haberse producido a través del conducto nasolagrimal y no a través de las neuronas. Aunque utilizamos la infección IT para prevenir la transmisión temprana a los ojos a través del conducto nasolagrimal (Fig. 4), los virus descendientes posteriores a la inoculación pueden moverse hacia los ojos a través del conducto nasolagrimal después de la replicación viral en los pulmones, lo cual no se ha investigado en este estudio. estudiar. Se justifican más estudios sobre la replicación viral en el tracto respiratorio superior en condiciones que dejen de propagarse a los ojos a través del conducto nasolagrimal.

Un estudio clínico reciente reveló que los pacientes con COVID-19 presentaban lesiones en la capa de células ganglionares y en la capa plexiforme interna de ambos ojos46. Además, otro estudio clínico informó que los pacientes presentaban hemorragias en forma de llama a lo largo de las arcadas vasculares retinianas y hemorragias retinianas periféricas47. La ruptura de la barrera hematorretiniana puede provocar infiltración de células inmunitarias y acumulación anormal de líquido dentro de la retina tras un aumento del grosor de la retina48. En este estudio, hemos observado infiltración de células inmunes en la capa nuclear interna y en la capa de células ganglionares, pero también hubo un marcado aumento en la capa nuclear externa junto con aumentos generales del grosor de la retina en ratones infectados con SARS-CoV-2 IN ( Fig. 2a, cy Fig. complementaria 5). Los aumentos en las capas retinianas vecinas pueden deberse a la acumulación de líquido extracelular resultante de la ruptura de la barrera hematorretiniana en el plexo vascular profundo de la retina49. Por tanto, suponemos que tanto la acumulación anormal de líquido dentro de la retina como la infiltración de células inmunitarias podrían estar implicadas en el aumento del grosor de la retina después de la infección por SARS-CoV-2 en este modelo animal.

La inflamación de la retina, diagnosticada en base a la retinitis, puede ocurrir después de la invasión directa o indirecta de patógenos como el citomegalovirus50, el virus chikungunya51 y el virus del Nilo Occidental52. Cuando la retinitis afecta a la fóvea o al disco óptico, puede exacerbarse hasta provocar una reducción o pérdida de la visión53. Además, la visión borrosa fue uno de los síntomas oculares más comunes en pacientes con COVID-192. Por lo tanto, elegimos la prueba del acantilado visual, que es fácil de realizar en una instalación BSL-3, para evaluar la reducción o pérdida de la visión de ratones infectados por SARS-CoV-2 con síntomas oculares (Fig. 3b-d) como prueba. Consecuencias funcionales de la inflamación de la retina. Aunque el número de ratones con el primer pie en el acantilado no cambió, la latencia para desmontar aumentó en los ratones infectados con síntomas oculares. Creemos que esto puede deberse a la visión borrosa debido a la secreción ocular. A pesar del aumento de la latencia, los ratones aún podían ver el acantilado y moverse hacia el lado seguro del banco.

Teniendo en cuenta que la infección viral, incluida la causada por el SARS-CoV-2, puede provocar manifestaciones oculares en humanos, varios estudios han investigado la propagación de los virus a los tejidos oculares. Los virus de la influenza dentro del subtipo H7 muestran tropismo ocular y utilizan los ojos como vía de entrada, lo que se confirmó mediante la administración del virus en la superficie corneal de hurones54. Aunque Imai et al. introdujeron una combinación de las vías IN y ocular para la inoculación del SARS-CoV-2, detectaron un virus infeccioso en los tejidos de los párpados de hámsteres sirios36. En este estudio, examinamos la diseminación del SARS-CoV-2 a los tejidos oculares después de la infección IN y evaluamos si la ruta de infección se puede revertir administrando el virus en los ojos. Nuestros datos sugieren la unidireccionalidad de la ruta infecciosa, desde los pulmones a los ojos, en estos modelos animales donde ACE2 se expresó en las córneas de los ojos (Figuras complementarias 9, 10). En particular, la carga viral de los globos oculares fue comparativamente baja y desapareció con el tiempo, lo que sugiere la ausencia de proliferación viral en los ojos (Fig. 4c). No se detectaron partículas virales infecciosas en los ojos de hámsteres sirios después de la infección por DE a 6 ppp (Fig. 6d). El análisis prolongado de los niveles de ARN viral después de la infección por DE en los pulmones, el cerebro, los globos oculares, TN y ON de ratones K18-hACE2 y hámsteres sirios a 3, 6, 9 y 12 ppp reveló que la infección de bajo nivel de TN y ON a 3 y 6 ppp no ​​provocó infección cerebral con el tiempo. No hubo pérdida de peso en los ratones infectados con DE hasta los 18 ppp y en los hámsteres infectados con DE hasta los 12 ppp (Figura complementaria 11).

Esta unidireccionalidad de la vía infecciosa puede deberse a la formación de la película lagrimal y al parpadeo. La película lagrimal desempeña un papel importante en el sistema inmunológico innato de los ojos para la protección contra patógenos potenciales, incluidos la lisozima, la lactoferrina, la inmunoglobulina A secretora y el complemento producido en la glándula lagrimal55. Se sabe que la lisozima confiere actividad anti-VIH56. La lactoferrina puede actuar como detergente catiónico y alterar la membrana celular de algunas bacterias, hongos y virus57. La inmunoglobulina A secretora posiblemente previene la adhesión del patógeno a las células huésped, bloqueando una mayor infección viral en las superficies mucosas58, y es quimiotáctica para los neutrófilos fagocíticos59. Los factores del complemento funcionalmente activos en las lágrimas están involucrados en respuestas inflamatorias agudas, contribuyendo a la defensa innata contra patógenos60. Por tanto, los componentes antimicrobianos de la película lagrimal podrían proporcionar un entorno inmunológico y protector contra las infecciones virales. Además, el acto de parpadear proporciona no sólo protección física contra contaminantes externos, sino que también ayuda en el drenaje de la película lagrimal desde el punto lagrimal61.

Estudios clínicos han informado que el tiempo necesario para la manifestación ocular varió de 15 días a dos meses después de la infección o del inicio de los síntomas8,62. Además, Colavita et al. detectaron ARN viral en los hisopos oculares con valores de Ct más bajos que los de los hisopos nasales de un paciente con COVID-19 que padeció manifestaciones oculares entre los 21 y 27 días del inicio de los síntomas63. Curiosamente, también aislaron virus vivos capaces de replicarse directamente del líquido ocular extraído del paciente. De acuerdo con los resultados de estos estudios clínicos, se detectaron copias virales administradas por IN e IT en los globos oculares, que aumentaron de manera dependiente del tiempo (Fig. 4c).

En resumen, la infección por SARS-CoV-2 en el modelo de ratón promovió las manifestaciones oculares y la inflamación de la retina, lo que aumentó la producción de citoquinas. El virus se propaga desde los pulmones al cerebro y a los ojos a través de una red formada por TN y ON. Este tropismo ocular también se observó en hámsteres sirios de tipo salvaje. Sin embargo, la provocación de inflamación ocular por una infección viral de los ojos y su relevancia clínica siguen siendo desconocidas y justifican una mayor investigación. Junto con el sistema respiratorio, los ojos y el TN deben considerarse sistemas de órganos susceptibles al SARS-CoV-2. Nuestros datos aumentan la conciencia sobre los trastornos mediados por infecciones oculares y neuronales más allá de las enfermedades respiratorias, lo que ayudará a diseñar estrategias de tratamiento para pacientes con COVID-19.

Todos los procedimientos se realizaron en una instalación de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) o BSL-3 para animales para experimentos relacionados con el SARS-CoV-2, y por personal equipado con respiradores purificadores de aire motorizados.

Se adquirieron ratones B6.Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J machos y hembras de ocho semanas de edad del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EE. UU.), y hembras K18-hACE2 C57BL de 6 a 7 semanas de edad. Se obtuvieron /6 ratones del Animal Resource Centre (Perth, Australia). Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación de Tecnología Química de Corea (Protocolo ID 8A-M6, IACUC ID 2021-8A-02-01 y 2021-8A-03-03). Los experimentos de inmunohistoquímica (Fig. 2c y Figs. Suplementarias 2, 5, 10) fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Griffith (MHIQ/08/21) y los procedimientos se ajustaron al Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h a 22–24 °C, con 40–55% de humedad y se les suministró comida y agua según se deseaba.

Se adquirieron hámsteres sirios dorados hembra de once semanas de edad (cepa RjHan:AURA) de Janvier Labs (Saint-Berthevin, Francia). Los hámsteres se mantuvieron en jaulas estándar de una instalación de nivel 3 de bioseguridad animal (ABL-3) y se expusieron a un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h a 22-24 °C, con 40-55% de humedad y alimento y agua suministrados según sea necesario. deseado. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea (KRIBB-ACE-21329, KRIBB-IBC-20220201).

En este estudio, una pérdida de peso del 25% se consideró el criterio de eutanasia humanitaria mediante asfixia con CO2. Los tejidos de los órganos se recogieron a los dpi indicados después de que los animales fueron anestesiados usando ketamina/xilazina (160 mg/kg de ketamina y 16 mg/kg de xilazina) o isoflurano en presencia de oxígeno en una cámara de inducción durante 5 minutos, seguido de perfusión con 10 ml de PBS frío, permitiendo que la sangre fluya. Los tejidos se pesaron y homogeneizaron en tubos de cuentas de acero precargados que contenían PBS frío utilizando tacoPrep Bead Beater (GeneReach Biotechnology Corp., ciudad de Taichung, Taiwán).

La cepa SARS-CoV-2 (ID de acceso de GISAID: EPI_ISL_407193) se propagó en células Vero (CCL-81, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.). El clon pCC1-4K-SARS-CoV-2-mCherry (n.º de acceso de GenBank MT926411) se utilizó para el rescate de virus infecciosos siguiendo el protocolo desarrollado por la ref. 32. Brevemente, se transfectaron 3 μg de ADN plasmídico en células BHK-21 (CCL-10, ATCC) en una placa de seis pocillos usando Lipofectamine LTX con reactivo Plus (15338100, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Tres días después de la transfección, el sobrenadante se transfirió a células Vero en un matraz T25. Después de una incubación adicional durante cuatro días, el virus infeccioso se tituló utilizando un ensayo en placa.

El virus se diluyó en serie en medio esencial mínimo (MEM) de Eagle suplementado con suero bovino fetal al 2% para el ensayo de placa. El medio de cultivo se eliminó de las células Vero E6 en una placa de 24 pocillos (~1 x 105 por pocillo) un día antes del ensayo, y el inóculo se transfirió a monocapas de células por triplicado. Después de la incubación a 37 °C durante 1 h, se eliminó el inóculo y las células infectadas se cubrieron con carboximetilcelulosa al 1,8% en MEM. Las muestras se incubaron durante cuatro días, seguido de fijación y tinción con cristal violeta al 0,05% que contenía formaldehído al 1%. Las placas se contaron y midieron utilizando un analizador y software ImmunoSpot versión 5.0 (Cellular Technology Ltd, Shaker Heights, OH, EE. UU.).

Todas las inoculaciones virales (SARS-CoV-2 diluido en PBS, una dosis de 104 PFU) se administraron por vía IN, IT, IC, ED e IV bajo anestesia usando isoflurano o ketamina/xilazina (160 mg/kg de ketamina y 16 mg/ kg de xilazina) en una instalación para animales BSL-3, y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales. Las inyecciones IN, IC e IV se realizaron según un protocolo previamente informado64. Al grupo simulado se le inyectó el mismo volumen de PBS en todos los experimentos. Los pesos corporales se midieron todos los días después de la infección.

Los ratones se infectaron con veinte microlitros de inóculo por ratón. Se anestesió al ratón y se administró el inóculo gota a gota en una fosa nasal.

El protocolo para la inyección IT se ha descrito previamente65. Se inyectaron veinte microlitros de la suspensión viral por ratón. Los ratones anestesiados fueron colocados sobre la cuerda por los dientes frontales, con el pecho colgando verticalmente sobre la plataforma. La parte superior del cofre estaba iluminada con una luz de alta intensidad. Se abrió la boca y se sacó la lengua con unas pinzas planas para ver la luz blanca de la tráquea. Se insertó el catéter en la tráquea y luego se retiró la aguja. El inóculo se inyectó directamente en la abertura del catéter. La inyección IT se ensayó utilizando una solución al 2 % de azul de Evans en solución salina normal (E2129, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)

Se inyectaron diez microlitros del inóculo por ratón anestesiado. Antes de la inyección, el inóculo se cargó en una jeringa de vidrio de microlitros (80401, Hamilton, Reno, NV, EE. UU.) con una aguja desechable ultrafina de 30 G × 4 mm (0J293, Jeongrim Medical, Chungcheongbuk-do, República de Corea). . El lugar de la inyección estaba a medio camino entre los ojos y los oídos e inmediatamente fuera de la línea media. La aguja se utilizó para penetrar directa y lentamente el cráneo. La inyección se realizó muy lentamente y fue seguida por una extracción lenta para evitar el flujo de salida. La inyección IC se ensayó utilizando una solución al 2% de azul de Evans en solución salina normal.

Se administraron gota a gota cuatro microlitros del inóculo directamente sobre la superficie corneal de ambos ojos sin ninguna escarificación, seguido de un masaje de los párpados.

Se inyectaron cincuenta microlitros del inóculo por ratón. Los ratones se colocaron en dispositivos de restricción para roedores con acceso a la cola y el inóculo se inyectó lentamente en la vena de la cola utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G 1/2 (BD, Nueva Jersey, EE. UU.).

El ARN total se extrajo de los homogeneizados utilizando el kit de tejido Maxwell RSC SimplyRNA (AS1340, Promega, Madison, WI, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. La RT-PCR cuantitativa (QuantStudio 3, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) se realizó utilizando una mezcla de RT-qPCR Prime script III de un solo paso (RR600A, Takara, Kyoto, Japón). El ARN viral de NP se detectó utilizando una sonda 2019-nCoV-N1 (10006770, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, EE. UU.).

Los ojos de ratones infectados con SARS-CoV-2 se diseccionaron a 0, 3 y 6 ppp y luego se homogeneizaron en tubos de perlas (a-psbt, GeneReach Biotechnology, Taichung, Taiwán). Las alícuotas se analizaron utilizando el panel de perlas magnéticas de citocinas/quimiocinas humanas MILLIPLEX (HCYTOMAG-60K, Merck Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) utilizando los instrumentos de multiplexación Luminex 200 (40-012, Merck Millipore) para evaluar la expresión de citocinas/quimiocinas.

El protocolo para secciones de ojos de ratón se describió anteriormente66. Los ojos, incluidos los apéndices, se recogieron y se fijaron durante la noche con fijador de Davidson (BBC Biochemical, Mount Vernon, WA, EE. UU.). Los ojos fijos fueron extirpados para equilibrar la presión y preservar la morfología. Luego se procesaron de forma rutinaria y se incluyeron en cera de parafina (ASP300S, Leica, Wetzlar, Alemania). Posteriormente, los ojos se cortaron en secciones transversales de retina de 7 μm y se tiñeron con H&E (BBC Biochemical) utilizando un tinte automático (ST5010, Leica). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Tokio, Japón). El espesor de la retina se midió utilizando el software Nuance 3.02 (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.).

Se realizaron criosecciones y tinciones de inmunofluorescencia67. Los ratones K18-hACE2 se sacrificaron mediante asfixia con CO2 o inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina el día 6 después de la infección. Los ojos, incluidos los apéndices, se recogieron y fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 2 horas o durante la noche. Después de una incubación durante la noche en sacarosa al 20 % o en sacarosa al 30 % durante 6 h a 4 °C, se transfirieron a un molde criogénico para su inclusión en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (AGR1180, Agar Scientific, Essex, Reino Unido) y se congelaron. a -80 °C durante la noche. Se lavaron secciones transversales de retina de diez micrómetros obtenidas del bloque de tejido congelado OCT tres veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,5% en PBS) durante 5 minutos para eliminar la OCT. Luego, las secciones se incubaron con tampón de bloqueo (2% de albúmina sérica bovina (BSA), 10% de suero de cabra normal en PBS) durante 1 h, seguido de una incubación adicional durante la noche a 4 °C con anticuerpos contra la proteína de pico (40150-T62- COV-2, Sino Biological, Beijing, China; 1:100), γ-sinucleína (sc-65979 AF488, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.; 1:50), Gr-1 (550291, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.; 1:300), CD3 (100366, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.; 1:350), CD4 (550280, BD Biosciences; 1:400), CD8 (550281, BD Biosciences; 1: 400), ACE2 humana (ab15348, Abcam, Cambridge, Reino Unido; 1:350) y ACE2 (MAB933, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.; 1:100) en tampón de lavado que contiene BSA al 1 %. Después del lavado, los anticuerpos primarios se detectaron utilizando AlexaFluor 488, AlexaFluor 568, AlexaFluor 647 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; 1:1000), AlexaFluor 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.; 1:1000) o estreptavidina DyLight650 (Thermo Fisher Scientific). Los núcleos se tiñeron con DAPI (62247, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los portaobjetos se montaron con el agente antidecoloración ProLong Gold (Thermo Fisher). La inmunofluorescencia se observó mediante microscopía confocal (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se tomaron imágenes de pilas Z (13 cortes) y se fusionaron para formar una proyección de máxima intensidad. Algunas imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal (Olympus FV3000, Olympus, Tokio, Japón) con una resolución de 1024 × 1024 utilizando objetivos de 20 × y 40 × (con zoom de 2x) y se procesaron utilizando FV31S-DT (software integrado de Olympus).

Se realizó una prueba de acantilado visual basada en el protocolo desarrollado por la ref. 68 con algunas modificaciones. Los ratones fueron probados en una caja de vidrio acrílico abierta (40 × 30 × 50 cm). La fuente de luz en la sala experimental se atenuó (aproximadamente 20 lux). Las barreras eran opacas para impedir la reflexión. Debajo de la mitad del plato ('lado del banco') se colocó un papel con un gran patrón de cuadros blancos y negros (2 × 2 cm2), mientras que la parte inferior de la otra mitad ('lado del acantilado') se cubrió con un pequeño papel a cuadros. Hoja de patrón (1 × 1 cm2) para enfatizar la caída del acantilado. Los ratones se colocaron en la plataforma central negra (0,4 × 30 × 0,1 cm) entre el lado del banco y el lado del acantilado, y sus actividades se registraron durante 2 minutos para medir la latencia para desmontar y la dirección del primer pie en el banco. o acantilados.

Se sacrificaron ratones infectados con SARS-CoV-2-mCherry a 6 ppp y se les perfundió con paraformaldehído al 4% en PBS. Se recolectaron inmediatamente los pulmones, el cerebro y otros órganos para detectar señales fluorescentes. Utilizando el sistema IVIS Lumina S5 (PerkinElmer, Wrentham, MA, EE. UU.), se tomaron imágenes de los tejidos secuencialmente con un filtro de emisión fijo a 520 nm para determinar la excitación óptima de 420 a 480 nm (1 s, F-stop = 1, medio agrupamiento). Las imágenes se analizaron utilizando el software Living Image 4.7 (PerkinElmer, Wrentham, MA, EE. UU.). La epifluorescencia se expresó en unidades de eficiencia radiante [p/seg/cm2/sr]/[μW/cm2] después de restar la señal de fondo.

Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces. Todos los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se mostraron como medias con el error estándar de la media (SEM). Para experimentos con solo dos grupos, se utilizó una prueba t de dos colas no apareada. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para experimentos con tres o más grupos. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los métodos analíticos específicos se describen en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos fuente generados en este estudio se proporcionan con este artículo. Los datos de origen se proporcionan con este documento como un archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Investigación de Ciencia y Tecnología (NST) financiadas por el gobierno coreano (MSIP; CRC-16-01-KRICT a Y.-CK), (MSIT; CRC21021, KRIBB KGM5242221 a H. -JK), Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (MSIT) del gobierno coreano (2020R1C1C1003379 a Y.-CK) y la subvención del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC) (APP1184879 a SM). SM recibió la beca de investigación senior del NHMRC (APP1154347).

Hye Jin Shin

Dirección actual: Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Chungnam, Daejeon, 35015, República de Corea

Estos autores contribuyeron igualmente: Gi Uk Jeong, Hyung-Jun Kwon.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Suresh Mahalingam, Young-Chan Kwon.

Departamento de Investigación Convergente de Infecciones por Virus Emergentes, Instituto de Investigación de Tecnología Química de Corea, Daejeon, 34114, República de Corea

Gi Uk Jeong, Hyun Woo Moon, Gun Young Yoon, Hye Jin Shin, Chonsaeng Kim, Dae-Gyun Ahn, Kyun-Do Kim, Seong-Jun Kim y Young-Chan Kwon

Departamento de Centro de Investigación de Biomateriales Funcionales, Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, Jeongeup, 56212, República de Corea

Hyung-Jun Kwon, In-Chul Lee y Young Bae Ryu

Centro para el desarrollo de nuevos fármacos para animales de compañía, sucursal de Jeonbuk, Instituto de Toxicología de Corea, Jeongeup, 53212, República de Corea

Hyung Jun Kwon e In Chul Lee

Grupo de Virus Emergentes, Inflamación y Terapéutica, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, QLD, Australia

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Nicholas JC King, Adam Taylor y Suresh Mahalingam

Centro de excelencia en arbovirus de la Red Global de Virus (GVN), Universidad Griffith, Gold Coast, QLD, Australia

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Adam Taylor y Suresh Mahalingam

Facultad de Farmacia y Ciencias Médicas, Universidad Griffith, Gold Coast, QLD, Australia

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Adam Taylor y Suresh Mahalingam

Laboratorio de Inmunopatología Viral, Centro Charles Perkins, Universidad de Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australia

Zheng Lung Ling, Alanna G. Spiteri y Nicholas JC King

Facultad de Ciencias Médicas, Facultad de Medicina y Salud, Universidad de Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australia

Zheng Lung Ling, Alanna G. Spiteri y Nicholas JC King

Instituto de Enfermedades Infecciosas de Sydney, Universidad de Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australia

Nicolás JC Rey

Sydney Nano, Universidad de Sydney, Sydney, Nueva Gales del Sur, 2006, Australia

Nicolás JC Rey

Departamento de Ciencias de la Vida, PerkinElmer, Seúl, 08380, República de Corea

Ji Soo Chae

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GUJ e Y.-CK concibieron y SM, NJCK e Y.-CK supervisaron este estudio. GUJ, H.-JK, SM e Y.-CK diseñaron experimentos. GUJ, H.-JK, WHN, XL, ZLL, AGS, NJCK, AT, HWM, GYY, H.-JS, I.-CL y D.-GA realizaron experimentos. GUJ, JSC, SM e Y.-CK analizaron los datos. H.-JK, S.-JK, SM e Y.-CK proporcionaron reactivos esenciales. GUJ, HJ.K., SM e Y.-CK escribieron el manuscrito. SM e Y.-CK son autores principales conjuntos. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Young-Chan Kwon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Eric Song y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Jeong, GU, Kwon, HJ., Ng, WH et al. Tropismo ocular del SARS-CoV-2 en modelos animales con inflamación de la retina mediante invasión neuronal tras la inoculación intranasal. Nat Comuna 13, 7675 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35225-1

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Recibido: 03 de mayo de 2022

Aceptado: 22 de noviembre de 2022

Publicado: 12 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35225-1

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