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Jul 29, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 11432 (2022) Citar este artículo

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Nuestro estudio anterior demostró que hsa-miR-143-3p es uno de los miARN altamente expresados ​​en células madre epiteliales corneales enriquecidas (CESC). Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo dilucidar el papel regulador de hsa-miR-143-3p en el mantenimiento de la potencia en CESC. Los genes diana de hsa-miR-143-3p se predijeron y se sometieron a análisis de ruta para seleccionar los objetivos para estudios funcionales. Se transfectaron células epiteliales del limbo cultivadas primarias con un imitador, inhibidor o secuencia codificada de hsa-miR-143-3p utilizando Lipofectamine 3000. Las células transfectadas se analizaron para determinar (i) potencial de formación de colonias, (ii) expresión de marcadores de células madre (SC)/ factores de transcripción (ABCG2, NANOG, OCT4, KLF4, ΔNp63), (iii) marcador de diferenciación (Cx43), (iv) cinco objetivos predichos de hsa-miR-143-3p (DVL3, MAPK1, MAPK14, KRAS y KAT6A), ( v) reguladores de señalización MAPK y (vi) reguladores de señalización Wnt-β-catenina mediante qPCR, tinción por inmunofluorescencia y/o transferencia Western. La alta expresión de hsa-miR-143-3p aumentó el potencial de formación de colonias (10,04 ± 1,35%, p <0,001) con la capacidad de formar colonias similares a holoclones en comparación con el control (3,33 ± 0,71%). Las células tratadas con imitación tenían una mayor expresión de marcadores SC pero una expresión reducida de los objetivos Cx43 y hsa-miR-143-3p involucrados en las vías de señalización Wnt-β-catenina y MAPK. La expresión de β-catenina, β-catenina activa y ERK2 en células transfectadas con inhibidor hsa-miR-143-3p fue mayor que en las células de control y la expresión nuclear localizada indicó la activación de la señalización de Wnt y MAPK. Así, se indicó la probable asociación de hsa-miR-143-3p en el mantenimiento de CESC mediante la inhibición de las vías de señalización Wnt y MAPK.

La córnea y la película lagrimal constituyen la ventana transparente anterior del ojo, que actúa como una barrera física entre el entorno óptico y externo. El epitelio corneal es la capa más externa de la córnea y se regenera a partir de las células madre epiteliales corneales (CESC) que están presentes en la capa basal del epitelio limbal1. Estas células madre residentes en tejidos adultos constituyen del 3 al 5% del epitelio limbal total y normalmente están inactivas. Sin embargo, la función principal de las CESC es gobernar procesos como la cicatrización de heridas2 y la homeostasis3 para mantener la transparencia corneal4. El mecanismo molecular detrás del mantenimiento de la potencia en las CESC aún no está claro, incluida la regulación epigenética por los microARN (miARN).

Los miARN son ARN monocatenarios no codificantes (de 18 a 24 nucleótidos) y regulan los niveles de proteína del ARN mensajero (ARNm) objetivo sin ninguna modificación en la secuencia genética5. Se sabe que los miARN participan activamente en diversos procesos celulares como la proliferación, diferenciación, metabolismo celular, homeostasis y apoptosis6,7.

En nuestro estudio anterior, las CESC se enriquecieron al 80% utilizando un protocolo de dos pasos8 y se compararon con células epiteliales corneales centrales diferenciadas mediante secuenciación de ARN pequeño. Se identificaron seis miARN: hsa-miR-3168, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-10a-5p y hsa-miR-1910-5p. para estar altamente expresado en las CESC enriquecidas y validado a través de qPCR. Curiosamente, basándose en la hibridación in situ del ácido nucleico bloqueado, se encontró que hsa-miR-143-3p se expresa en la capa basal del epitelio limbal, exclusivamente en los grupos de células pequeñas que indican su posible asociación con las CESC9. A continuación, en este estudio se evaluó el papel funcional de hsa-miR-143-3p en CESC.

En células madre embrionarias de ratón, hsa-miR-143-3p promovió la autorrenovación y aumentó la expresión de genes de pluripotencia como OCT4, KLF4 y ESRRB10. También se sabía que Hsa-miR-143-3p regulaba diversos procesos celulares como la diferenciación11, la proliferación12,13, la migración14, la apoptosis15,16 y la regulación del ciclo celular17.

En este estudio, para los estudios funcionales se utilizaron células epiteliales del limbo cultivadas mediante sistemas de cultivo 2D y 3D. The Real Architecture For 3D Tissue (3D RAFT) son hidrogeles a base de colágeno en los que están incrustadas células madre del estroma corneal (CSSC), que sirven como modelo de nicho de células madre del estroma corneal18. Por lo tanto, las células epiteliales del limbo cultivadas en las RAFT 3D tendrán una interacción estrecha con las CSSC similar a su entorno nativo. Los equivalentes de tejido epitelial o endotelial producidos mediante esta técnica son aptos para trasplante y se utilizan como modelo para estudiar interacciones celulares y características funcionales19,20. Esclarecer el mecanismo de señalización detrás de la regulación de las CESC por parte de hsa-miR-143-3p allanará la plataforma para desarrollar nuevas técnicas de cultivo basadas en miARN para expandir las CESC para trasplantes y terapias con células madre para tratar a pacientes con deficiencia de células madre del limbo (LSCD).

Los globos enucleados del donante no aptos para trasplante y los bordes limbales recibidos después del trasplante de córnea (edad del donante menor de 73 años) se obtuvieron del Rotary Aravind International Eye Bank (Madurai, India), Moorfields Eye Hospital Lions Eye Bank (Londres, Reino Unido) y Veneto Eye. Fundación Bancaria (Venecia, Italia). En el estudio se utilizaron tejidos no vascularizados con limbo intacto después de un examen minucioso bajo microscopio estereobinocular. Los tejidos de donantes humanos se manipularon de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Fundación de Investigación Médica Aravind (RES2013038BAS) y el Moorfields Eye Hospital/UCL Institute of Ophthalmology Eye Tissue Repository (10/H0106/57-2011ETR10). El consentimiento informado para el uso de ojos de donantes para investigación se obtuvo de los representantes legalmente autorizados.

Los objetivos de hsa-miR-143-3p se predijeron utilizando miRWalk (Versión 3.0)21 y mirDIP (Versión 4.1.1.6)22. Se seleccionaron los objetivos que eran comunes tanto en miRWalk como en mirDIP para evitar falsos positivos. Los objetivos seleccionados se sometieron a análisis mediante la herramienta de mapeo de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG), ruta de búsqueda en el mapeador KEGG y se agruparon en categorías funcionales. Se seleccionaron los objetivos asociados con la regulación de las células madre para su posterior análisis.

Se cultivaron células epiteliales del limbo a partir de explantes del limbo de 2 mm disecados de los globos o bordes del limbo del donante. Los explantes se colocaron en una placa de cultivo celular de 35 mm recubierta con medio epitelial hormonal suplementado (SHEM) (Nunc, Thermofisher Scientific, Massachusetts, Estados Unidos) con el lado epitelial hacia arriba. Los explantes se incubaron a 37 °C durante 20 minutos para permitir su fijación a la placa de cultivo. Luego, los explantes adjuntos se cultivaron en SHEM a 37 °C y 5% de CO2. Los medios se cambiaron en días alternos hasta alcanzar una confluencia del 70 al 80%.

Se utilizaron RAFT 3D que contenían CSSC para el cultivo de células epiteliales del limbo primarias. Las células epiteliales del limbo se obtuvieron incubando los bordes del limbo en dispasa II (2 mg/ml) durante 45 min a 37 °C. Luego se raspó el epitelio del limbo con un bisturí estéril. El epitelio limbal total se sometió a tratamiento con tripsina (0,25%) durante 30 minutos para obtener células individuales24.

Para el cultivo de CSSC, se diseccionó la región limbal junto con el estroma anterior y se sometió a tratamiento con colagenasa-L (0,5 mg/ml) durante 16 h a 37 °C. Las células se separaron de la solución mediante centrifugación y el sedimento se resuspendió en 3 ml de medio CSSC25. Las células resuspendidas se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5% en un matraz T25 recubierto de fibronectina durante 24 h. Las células se suplementaron con medio CSSC fresco después de 24 h y se eliminaron las células no adheridas. El segundo día, se llevó a cabo una tripsinización selectiva para las CSSC con tripsina al 0,05 % y EDTA al 0,02 % (Invitrogen) y las CSSC se sembraron en un matraz T75 fresco recubierto de fibronectina. Las CSSC se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5% con cambio de medio cada día alterno. Con una confluencia del 60 al 70 %, las células se subcultivaron con una densidad de siembra de 3000 células/cm2 en un matraz nuevo. Para la preparación de 3D-RAFT, se utilizaron las CSSC en el pase 4, validadas para la expresión del marcador CSSC mediante inmunotinción.

Para la preparación de RAFT TE, se mezcló colágeno nativo AteloCell (dermis bovina, 3 mg/ml, pH 3,0, solución ácida de colágeno I-AC) (Koken, Tokio, Japón) con medio esencial mínimo (MEM) 10X del reactivo RAFT. kit (Lonza, Basilea, Suiza) en una proporción de 8:1. La solución de colágeno se ajustó a un pH entre 7,2 y 7,4 utilizando la solución neutralizante (hidróxido de sodio 5 M)26. La solución se centrifugó a 1000 rpm durante 3 min. Las CSSC (30.000 células/RAFT) se resuspendieron en el medio CSSC y se añadieron a la solución de colágeno. Se transfirió un volumen de 625 µl de solución de colágeno recién preparada con CSSC a cada pocillo de una placa de 24 pocillos (Greiner, Stonehouse, Reino Unido) y se calentó a 37 °C durante 30 minutos. Una vez formados los geles de colágeno, se aplicaron absorbentes RAFT para placas de 24 pocillos (absorbentes porosos hidrófilos) (Lonza) a la superficie de los hidrogeles durante 30 min. Luego, se retiraron suavemente los absorbentes y se añadió medio CSSC nuevo a los TE RAFT y se almacenó a 37 °C. Las células epiteliales del limbo se sembraron en placas de 24 pocillos con una densidad de 2,5 x 104 células/RAFT y se cultivaron en medio SHEM a 37 °C y 5% de CO2. Las células se cultivaron hasta que alcanzaron una confluencia del 70 al 80% con el cambio de medio cada día alterno.

La transfección de cultivos de células epiteliales limbales primarias humanas confluentes al 70-80% cultivados en sistemas de cultivo 2D y 3D se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 3000 (Thermofisher Scientific) con 25 nM de imitador de hsa-miR-143-3p (miScript miRNA Mimic , Qiagen, Hilden, Alemania) o inhibidor (miScript miRNA Inhibitor, Qiagen) o control de transfección: secuencia codificada (AllStars Negative Control siRNA, Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La transfección se llevó a cabo durante 4 h a 37 oC en una incubadora con CO2 al 5% y las células se suplementaron con SHEM. Después de 2 días de cultivo, las células transfectadas se recolectaron para los siguientes experimentos (i) ensayo de formación de colonias, (ii) tinción por inmunofluorescencia, (iii) aislamiento de ARN para análisis de qPCR y (iv) aislamiento de proteínas para transferencia Western. Los experimentos se repitieron tres veces con tres muestras biológicas (n = 3).

Las células transfectadas imitadoras o inhibidoras de hsa-miR-143-3p o control codificado se sembraron en una capa alimentadora de fibroblastos de ratón NIH 3T3 inactivada con mitomicina C (4 µg/ml, Sigma-Aldrich) en una placa de 60 mm de forma independiente a una densidad de siembra de 500 células. por plato. Después de 12 días de cultivo en SHEM, la capa de alimentación se eliminó con una solución de EDTA al 0,02 % (Sigma-Aldrich) y las colonias en la placa se tiñeron con rodamina B al 1 % (Roche, Basilea, Suiza) durante 30 minutos después de 15 minutos de fijación. con 4% de paraformaldehído (Sigma-Aldrich). Las colonias se lavaron con agua destilada estéril y se capturaron imágenes (cámara Nikon D750, Japón). La eficiencia de formación de colonias (CFE) se calculó utilizando la fórmula: número de colonias formadas / número de células sembradas × 100. Las colonias se denominaron holoclon con respecto a su tamaño y morfología según lo definido por Barrandon y Green27.

El ARN total se aisló utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen) de los tres grupos (i) tratados con imitación, (ii) tratados con inhibidor y (iii) tratados con mezcla. Se utilizó el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermofisher Scientific) para la transcripción inversa de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación de qPCR posterior se realizó durante 40 ciclos utilizando KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) (Sigma-Aldrich). Las condiciones del ciclo qPCR fueron (i) activación inicial durante 3 min a 95 °C, (ii) 40 ciclos de (a) desnaturalización durante 10 s a 95 °C, (b) recocido durante 20 s a 58 °C y (c ) extensión durante 30 s a 72 °C y (iii) extensión final durante 7 min a 72 °C. Se utilizó gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como ARNm de referencia. El experimento se repitió tres veces con las células epiteliales del limbo cultivadas mediante un sistema de cultivo 2D y los datos se representaron como la media ± desviación estándar (DE) del valor de expresión. Los cebadores utilizados para qPCR se enumeran en la tabla complementaria S1.

Las células transfectadas cultivadas en un sistema de cultivo 2D se tripsinizaron con TrypLE Express (Gibco-Thermofisher Scientific) después de 2 días de cultivo y se citocentrifugaron (400 rpm; 3 min) en los portaobjetos (2,5 x 104 células/portaobjetos). Las células se fijaron durante 20 min con paraformaldehído al 4% a 25 °C. Después de la fijación, las células se lavaron con 1X PBS (tres veces) y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 minutos a 25 °C. Después de la permeabilización, las células se lavaron con 1X PBS y se bloquearon con suero de cabra al 5% (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos. Luego, las células se incubaron con anticuerpo primario diluido en suero de cabra al 2% a 4 °C durante la noche (Tabla complementaria S2: Lista de anticuerpos utilizados para la inmunotinción). Las células se lavaron con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado (1:500) conjugado con fluoróforo (Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555) en PBS durante 60 minutos a 25 °C. Las células inmunoteñidas se montaron utilizando medio vectashield con DAPI (Vector laboratorios Ltd, Peterborough, Reino Unido) después de un lavado minucioso con PBS y se sellaron con cubreobjetos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (Zeiss LSM 700, Alemania) para analizar el patrón de localización de la expresión de proteínas. Para cada anticuerpo primario utilizado, se utilizó el control de isotipo correspondiente como control negativo. El experimento se replicó tres veces con tres muestras biológicas (n = 3). Las células transfectadas en 3D RAFT se inmunotiñeron directamente en las placas de cultivo y no se sometieron a tratamiento con tripsina. Para la cuantificación de la expresión de proteínas, las imágenes se tomaron con el microscopio de fluorescencia Axioskop 2 (Zeiss). La expresión del marcador se cuantificó con la función de histograma del software analizador HCImage en función de la intensidad media de la señal de fluorescencia en diferentes canales. La expresión relativa de proteínas basada en la intensidad de la fluorescencia se cuantificó como lo describen Lee et al.28.

Para el aislamiento de la proteína de las células transfectadas, las células se lisaron con la mezcla de tampón de lisis y extracción RIPA (Thermo Scientific) y cóctel inhibidor de proteasa Halt (Thermo Scientific) después de lavar con PBS helado (Gibco, Thermo Scientific). La concentración de la proteína aislada se estimó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Thermo Scientific). Se separaron cantidades iguales de proteína extraída de cada muestra (20 µg) mediante gel de Bis-tris al 10% (NuPAGE, Thermo Scientific) en condiciones reductoras después de calentar durante 10 minutos a 95 °C junto con el tampón de carga de muestra LDS (Thermo Scientific) .

Luego, las proteínas separadas se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Invitrolon, Thermo Scientific). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,1 % (TBST) y se incubó a 4 °C durante la noche con anticuerpo primario (Ab) (Tabla complementaria S3: Lista de anticuerpos primarios utilizados para la transferencia Western). Las membranas se lavaron tres veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante a 25 °C durante 1 h (Cell Signaling Technology, Inc., Massachusetts, Estados Unidos). Las bandas de proteínas se detectaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia mejorado después de un lavado minucioso con TBST (Millipore, Billerica, MA). En cada transferencia, se utilizó GAPDH como referencia de normalización y control de carga. El experimento se repitió tres veces utilizando las células epiteliales del limbo cultivadas en sistemas de cultivo 2D y 3D y los datos se representaron como la media ± DE. Para analizar múltiples proteínas de la misma transferencia y evitar pelados repetidos, la membrana se cortó en función del peso molecular de la proteína a analizar, antes de la hibridación con anticuerpos.

Para el análisis estadístico se utilizó el software estadístico STATA 14.0 (Texas, EE. UU.). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los datos se representaron como media ± DE. Se realizó una prueba t independiente (paramétrica) para comparar los dos grupos experimentales cuando los datos siguieron una distribución gaussiana y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney (no paramétrica) para los datos que siguieron una distribución no gaussiana basada en la normalidad de Shapiro-Wilk. prueba. Se consideró estadísticamente significativo p < 0,05.

Se obtuvo la aprobación del Comité de Ética Institucional, la Fundación de Investigación Médica Aravind (RES2013038BAS) y el Moorfields Eye Hospital/UCL Institute of Ophthalmology Eye Tissue Repository 10/H0106/57-2011ETR10. Los procedimientos utilizados en este estudio se ajustan a los principios de la Declaración de Helsinki.

Para todos los ojos de los donantes, incluidos los menores de edad, se obtuvo el consentimiento informado del representante legalmente autorizado, ya sea los padres o familiares del donante a través de los Bancos de Ojos.

Para hsa-miR-143-3p, miRWalk y mirDIP identificaron 1229 y 1661 genes diana respectivamente. Se enviaron un total de 276 genes diana comunes al mapeador KEGG y los genes diana putativos se agruparon en 231 vías KEGG. Las vías incluyeron la vía MAPK, la vía de señalización Wnt, la vía de señalización asociada con la pluripotencia de las células madre y la vía PI3K-AKT. Proteína 3 de polaridad del segmento desaliñado (DVL3), lisina acetiltransferasa 6A (KAT6A), homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten 2 (KRAS), proteína quinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1)/ERK2 y proteína quinasa 14 activada por mitógenos (MAPK14)/p38 MAPK fueron los cinco objetivos involucrados en las vías de señalización que regulan la pluripotencia de las células madre y fueron seleccionados para su posterior análisis. La vía KEGG29 que muestra estos genes diana seleccionados de hsa-miR-143-3p se representó en la Fig. S1.

Después de la transfección, las células transfectadas imitadoras de hsa-miR-143-3p mostraron una mayor expresión de hsa-miR-143-3p (44,35 ± 14,57, p <0,0001) y las células transfectadas con inhibidor tuvieron una expresión reducida (- 44,19 ± 4,39, p <0,0001 ) en comparación con el de las células de control (Fig. 1A). La expresión de los cinco ARNm diana seleccionados de hsa-miR-143-3p, (i) DVL3 (- 8,04 ± 0,47, p <0,0001), (ii) KAT6A (- 2,18 ± 0,23, p <0,0001), (iii) KRAS (- 8,31 ± 0,49, p < 0,0001), (iv) MAPK1 (- 5,59 ± 0,18, p < 0,0001) y (v) MAPK14 (- 5,56 ± 0,14, p < 0,0001) estaban regulados negativamente en células transfectadas mímicas en comparación con eso de las células de control. Sin embargo, en las células transfectadas con inhibidor su expresión aumentó significativamente (p <0,0001) (Fig. 1B). De manera similar, a nivel de proteína, las células transfectadas imitadoras tenían una expresión reducida de DVL3 (0,73 ± 0,07, p = 0,0024), KRAS (0,87 ± 0,04, p = 0,0037), MAPK1 (0,56 ± 0,18, p = 0,0145) y MAPK14 (0,42 ± 0,06, p = 0,0001) en comparación con el de las células de control mediante Western blot (Fig. 2, p <0,05) e inmunotinción (Fig. 3).

Perfil de expresión de ARNm de células transfectadas con hsa-miR-143-3p. Perfil de expresión de (a) hsa-miR-143-3p, (b) sus objetivos previstos, (c) marcadores de células madre, (d) marcador de diferenciación y (e) reguladores de señalización Wnt tras la transfección con hsa-miR-143-3p imitador e inhibidor. La expresión relativa de ARNm/miARN en células transfectadas con imitadores y transfectadas con inhibidores se cuantificó en comparación con el control mediante qPCR utilizando la química SYBR Green. Cada muestra (n = 3) se analizó por triplicado. Los datos se expresaron como media ± DE y el cambio relativo de expresión (RQ) se calculó mediante el método 2−∆∆CT después de la normalización con GAPDH (gen de referencia)/RNU6B (miARN de referencia). ***P < 0,0001.

Perfil de expresión de proteínas de células transfectadas con hsa-miR-143-3p cultivadas en un sistema de cultivo 2D. (a) Transferencias Western representativas de proteína de interés en tres grupos: imitador, inhibidor y control de hsa-miR-143-3p (n = 3): (i) objetivos de hsa-miR-143-3p: DVL3, KRAS, MAPK1 y MAPK14, (ii) marcadores de células madre: ABCG2 y ΔNp63α (iii) marcador de diferenciación: Cx43, (iv) reguladores de señalización Wnt: AXIN2, β-catenina y β-catenina activa y (v) reguladores de señalización MAPK: p-ERK1/2 , p-p38, p –c-JUN, p –c-FOS, p-ATF2 y p-p53. Se utilizó GAPDH como referencia de normalización y control de carga. Gráficos de barras que indican el perfil de expresión relativo de las proteínas cuantificadas mediante transferencia Western (b) objetivos hsa-miR-143-3p (c) marcadores de células madre (d) marcador de diferenciación (e) reguladores de señalización Wnt (f) reguladores de señalización MAPK. *P < 0,05; **P < 0,001. Los valores relativos de expresión de proteínas se proporcionan en la Tabla S4 y las imágenes originales de transferencias Western se proporcionan en la Fig. S2.

Localización de la expresión de proteínas en células transfectadas con hsa-miR-143-3p. Imágenes confocales representativas de células de cultivo primario del limbo transfectadas inmunoteñidas para DVL3, KRAS, MAPK1, MAPK14, β-catenina, β-catenina activa, AXIN2, ABCG2, p63⍺ y Cx43. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul) y la expresión de proteínas con Alexa Fluor 555 (verde) excepto ABCG2 con Alexa Fluor 488 (rojo). Barra de escala de 50 µm. Las imágenes detalladas del canal dividido junto con su intensidad fluorescente relativa se proporcionan en la Fig. S3.

A nivel de ARNm, las células imitadas transfectadas tuvieron una expresión significativamente mayor de marcadores de células madre en comparación con las células de control: (i) marcador universal de células madre, ABCG2 (16,36 ± 1,41, p <0,0001), (ii) marcador de células madre limbales, p63α ( 5,65 ± 0,79, p < 0,0001) y (iii) marcadores de células madre embrionarias, OCT4 (5,28 ± 1,25, p < 0,0001), NANOG (6,17 ± 0,41, p < 0,0001) y KLF4 (9,00 ± 1,00, p < 0,0001) ( Figura 1C). Por el contrario, la expresión del marcador de diferenciación conexina 43 (Cx43) se redujo en células imitadas transfectadas (- 7,27 ± 1,75, p <0,0001). Por otro lado, en las células transfectadas con inhibidor, la expresión de marcadores de células madre: ABCG2 (− 4,53 ± 0,34, p < 0,0001), p63α (− 10,13 ± 1,69), OCT4 (− 10,78 ± 4,31, p < 0,0001), NANOG (- 6,70 ± 2,00, p < 0,0001), KLF4 (- 18,13 ± 0,62, p < 0,0001) se redujeron y la expresión de Cx43 (6,85 ± 0,90, p < 0,0001) aumentó en comparación con las células de control (Figs. 1D, 3) .

El análisis confocal de las células transfectadas imitadas identificó un aumento significativo en el número de células (50,29 ± 1,81%, p <0,0001) que fueron doblemente positivas para ABCG2 y p63α que el control (11,96 ± 3,07%, p = 0,0025). En las células transfectadas con inhibidor, no había células que expresaran tanto ABCG2 como p63α (Fig. 3).

El análisis de transferencia Western de marcadores de células madre y marcador de diferenciación en las células transfectadas reveló que el nivel de expresión de ABCG2 (2,14 ± 0,47, p = 0,0134) y ΔNp63α (2,07 ± 0,37, p = 0,0074) estaban regulados positivamente y la expresión de Cx43 (0,23 ± 0,05, p <0,0001) se reguló negativamente en células imitadas transfectadas (Fig. 2).

Para confirmar la presencia de células madre en cultivos transfectados, se llevó a cabo un ensayo de formación de colonias. Las células tratadas con imitación mostraron un mayor porcentaje de eficiencia en la formación de colonias (10,04 ± 0,45, p = 0,0003) en comparación con el control (3,33 ± 0,23) y las células tratadas con inhibidor (0,26 ± 0,08, p = 0,0003). Además, hubo un aumento significativo en el porcentaje de colonias tipo holoclon (7,66 ± 2,45, p < 0,05) en comparación con el control (0,69 ± 2,08). Las células tratadas con inhibidor no produjeron una colonia tan grande (Fig. 4). Por lo tanto, la mayor expresión de hsa-miR-143-3p aumentó la eficiencia de formación de colonias y apoyó la formación de colonias similares a holoclones.

Potencial de formación de colonias de células transfectadas con hsa-miR-143-3p. ( a ) Colonias representativas de células epiteliales limbales teñidas con rodamina B después de 12 días de cultivo en los tres grupos: células transfectadas imitadoras de hsa-miR-143-3p, inhibidoras y de control. (b) El gráfico de barras que representa la eficiencia de formación de colonias de las células en los tres grupos. **P < 0,001.

La expresión de los reguladores de señalización Wnt CTNNB1 (- 6,44 ± 1,14, p <0,0001) y AXIN2 - 8,64 ± 4,06, p <0,0001) se reguló negativamente y el represor transcripcional de señalización Wnt TCF3 (8,96 ± 0,71, p <0,0001) se reguló positivamente en imitaciones transfectadas. grupo en comparación con el de control (Fig. 1E), mientras que fue inverso en el caso de células transfectadas con inhibidor.

A nivel de proteínas, la inmunotinción (Fig. 3) y las transferencias Western revelaron que la expresión de β-catenina (0,35 ± 0,12, p = 0,0006), β-catenina activa (0,61 ± 0,16, p = 0,0140) y AXIN2 (0,39 ± 0,21 , p = 0,0075) se redujeron en células transfectadas mímicas. En las células transfectadas con inhibidor, la expresión de β-catenina (2,00 ± 0,62, p = 0,0493), β-catenina activa (2,15 ± 0,43, p = 0,0095) y AXIN2 (3,69 ± 0,86, p = 0,0057) aumentaron en comparación con la de el control (Fig. 2, p < 0,05).

Los reguladores de señalización MAPK p-ERK1/2 (0,67 ± 0,13, p = 0,0128; 0,73 ± 0,12, p = 0,0183), p-p38 (0,47 ± 0,10, p = 0,0007), p –c-JUN (0,75 ± 0,14, p = 0,0342), p –c-FOS (0,55 ± 0,18, p = 0,0140), p-ATF2 (0,50 ± 0,09, p = 0,0008) y p-p53 (0,58 ± 0,17, p = 0,0115) estaban regulados a la baja en imitación células transfectadas. Sin embargo, la expresión de los reguladores de señalización MAPK aumentó en las células transfectadas con inhibidores (Fig. 2, p <0,05).

Las células epiteliales del limbo primarias cultivadas en los TE 3D RAFT, tras la transfección con imitadores, habían reducido la expresión de (i) objetivos hsa-miR-143-3p: DVL3 (0,69 ± 0,15, p = 0,0213), KRAS (0,47 ± 0,05, p = 0,0001), MAPK1 (0,76 ± 0,11, p = 0,0207) y MAPK14 (0,41 ± 0,05, p < 0,0001), (ii) marcador de diferenciación: Cx43 (0,47 ± 0,08, p = 0,0004), (iii) reguladores de señalización Wnt: AXIN2 (0,39 ± 0,09, p = 0,0004), β-catenina (0,77 ± 0,09, p = 0,0135) y β-catenina activa (0,39 ± 0,05, p < 0,0001) y (iv) reguladores de señalización MAPK:p-ERK1/2 (0,60 ± 0,06, p = 0,0004; 0,74 ± 0,02, p < 0,0001), p-p38 (0,50 ± 0,10, p = 0,0011), p–c-JUN (0,63 ± 0,17, p = 0,0211), p–c- FOS (0,70 ± 0,18, p = 0,0466), p-ATF2 (0,73 ± 0,08, p = 0,0044) y p-p53 (0,73 ± 0,12, p = 0,0193). Sin embargo, la expresión de los marcadores de células madre ABCG2 (1,88 ± 0,21, p = 0,0019) y ΔNp63α (2,31 ± 0,68, p = 0,0299) aumentó en las células imitadas transfectadas en comparación con la del control (Fig. 5, p <0,05). . En las células transfectadas imitadas, la positividad de β-catenina, β-catenina activa y ERK2 se limitó a la membrana celular. Pero en las células transfectadas con inhibidor, la positividad se observó tanto en la membrana como en el núcleo, lo que indica una translocación nuclear (Fig. 6).

Perfil de expresión de proteínas de células transfectadas con hsa-miR-143-3p cultivadas en un sistema de cultivo 3D RAFT. (a) Transferencias Western representativas de proteína de interés en tres grupos: hsa-miR-143-3p imitan, inhibidor y control de células cultivadas 3D RAFT transfectadas (n = 3): (i) objetivos hsa-miR-143-3p: DVL3 , KRAS, MAPK1 y MAPK14, (ii) marcadores de células madre: ABCG2 y ΔNp63α (iii) marcador de diferenciación, Cx43, (iv) reguladores de señalización Wnt: AXIN2, β-catenina y β-catenina activa y (v) reguladores de señalización MAPK: p-ERK1/2, p-p38, p-c-JUN, p-c-FOS, p-ATF2 y p-p53. Se utilizó GAPDH como referencia de normalización y control de carga. Gráficos de barras que indican el perfil de expresión relativo de las proteínas cuantificadas mediante transferencia Western (b) objetivos hsa-miR-143-3p (c) marcadores de células madre (d) marcador de diferenciación (e) reguladores de señalización Wnt (f) reguladores de señalización MAPK. *P < 0,05; **P < 0,001; ***P < 0,0001. Los valores relativos de expresión de proteínas se proporcionan en la Tabla S5 y las imágenes originales de transferencias Western se proporcionan en la Fig. S4.

Localización de β-catenina, β-catenina activa y expresión de ERK2 en células transfectadas con hsa-miR-143-3p en 3D RAFT. Imágenes confocales representativas de células epiteliales limbales primarias transfectadas cultivadas en TE 3D RAFT inmunoteñidas para (a) β-catenina, (b) β-catenina activa y (c) ERK2. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul) y la expresión de proteínas con Alexa Fluor 555 (rojo). En comparación con las células transfectadas de control y mímicas, la expresión de β-catenina, β-catenina activa y ERK2 fue mayor en las células transfectadas con inhibidor junto con una fuerte translocación nuclear. Los valores relativos de expresión de proteínas basados ​​en la intensidad fluorescente se proporcionan en la Fig. S5. Barra de escala de 50 µm. La localización nuclear de β-catenina activa y ERK2 indica la activación de la señalización de Wnt-β-catenina y MAPK, respectivamente.

Recientemente se ha identificado el papel regulador de los miARN en varias células madre. Los miARN modulan las vías de señalización mediante la focalización selectiva de las moléculas involucradas30,31. Para el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas, miR-143 reguló negativamente la señalización de TGFβ/DAB2 dependiente de Smad32. En las células madre mesenquimales de la médula ósea y las células madre papilares apicales, miR-143-3p reguló negativamente el proceso de diferenciación al apuntar a la proteína morfogenética ósea 233 y al factor nuclear I-C34, respectivamente. Por el contrario, apoyó la diferenciación en células madre de pulpa dental humana al dirigirse a la vía de señalización de osteoprotegerina-RANK35. Aunque se identificó la expresión de hsa-miR-143-3p en varios tejidos oculares11,36,37,38, no se ha explorado su asociación funcional.

Nuestro estudio anterior sobre el perfil de miARN de CESC enriquecidas9 sugirió el posible papel de hsa-miR-143-3p en el mantenimiento de la potencia en CESC. A continuación, la expresión ectópica de hsa-miR-143-3p en este estudio aumentó el potencial de formación de colonias de células epiteliales limbales cultivadas junto con un mayor número de colonias similares a holoclones según el tamaño y la morfología. Además, la expresión de los marcadores de células madre aumentó y la expresión del marcador de diferenciación disminuyó en las células transfectadas mímicas. Por lo tanto, estos resultados indicaron colectivamente la asociación de hsa-miR-143-3p en el mantenimiento de la potencia en CESC.

Se ha informado de la asociación de la señalización de Wnt y MAPK en el mantenimiento y diferenciación de las células madre. En cultivos de explantes limbales, tras la inhibición de la señalización Wnt28 y MAPK39,40, se incrementó la expresión de marcadores de células madre (ABCG2 y p63α) y la eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, en el cultivo en suspensión de células epiteliales del limbo aisladas, la activación de la señalización Wnt41 y MAPK42 condujo a una reducción de la eficiencia de formación de colonias y del número de células que expresan altos niveles de p63α en colonias limbales cultivadas.

Las células imitadas transfectadas mostraron una expresión reducida de cuatro objetivos previstos de hsa-miR-143-3p: KRAS, MAPK1 (ERK2), MAPK14 (p38α) y DVL3. Aunque los objetivos previstos estaban regulados a la baja, el estudio no ha validado si estos objetivos son los objetivos directos de hsa-miR-143-3p. Entre los objetivos, se informó que KRAS era un objetivo directo conocido de miR-143-3p43,44,45. Se ha tabulado el papel regulador de los objetivos previstos de hsa-miR-143-3p en la señalización de Wnt y MAPK (Tabla 1). La expresión de los reguladores de señalización Wnt: AXIN2, β-catenina, β-catenina activa y reguladores de señalización MAPK: p-ERK1/2, p-p38, p –c-JUN, p –c-FOS, p-ATF2, p- p53 se reguló negativamente en células transfectadas imitadas, lo que indica la inhibición de la señalización de Wnt-β-catenina y MAPK.

Con base en las observaciones anteriores, planteamos la hipótesis de un probable mecanismo de acción de hsa-miR-143-3p en la señalización de Wnt y MAPK que se resume en la Fig. 7.

Mecanismo postulado de regulación de la señalización Wnt y MAPK por hsa-miR-143-3p. Hsa-miR-143-3p inhibe la señalización Wnt regulando negativamente la expresión de sus objetivos (i) MAPK14 (p38) y KRAS inhibe GSK3β, un represor de la señalización Wnt, (ii) DVL3: activa la señalización Wnt disociando el complejo de destrucción y (iii) MAPK1 (ERK2): activa el correceptor Wnt LRP6 mediante fosforilación e inicia la señalización de Wnt. Hsa-miR-143-3p inhibe la señalización MAPK mediante la regulación negativa de sus objetivos (i) DVL3: inicia la señalización JNK MAPK mediante la activación de la proteína RAC (ii) KRAS: activa la señalización ERK MAPK mediante la activación de la proteína RAF (iii) MAPK14: activador de Señalización p38-MAPK y (iv) activador MAPK1 de la señalización ERK MAPK.

Hsa-miR-143-3p inhibe la señalización Wnt regulando negativamente la expresión de sus objetivos (i) MAPK14 (p38): inhibe GSK3β, un represor de la señalización Wnt (ii) DVL3 activa la señalización Wnt disociando el complejo de destrucción e iniciando p38 la inhibición mediada por GSK3β (iii) MAPK1 (ERK2): activa el correceptor Wnt LRP6 mediante fosforilación y, por lo tanto, facilita la señalización de Wnt y (iv) KRAS inhibe GSK3β y estabiliza la β-catenina mediante fosforilación directa.

Hsa-miR-143-3p inhibe la señalización de MAPK al regular negativamente la expresión de sus objetivos (i) la activación de MAPK14 de MAPK14 es el paso esencial y marca la activación de la señalización de p38 MAPK, (ii) DVL3 inicia la señalización de JNK MAPK a través de la activación de la proteína RAC, (iii) MAPK1: la activación y translocación de MAPK1 al núcleo es el paso crucial en la activación de la señalización de ERK MAPK y (iv) KRAS activa la señalización de ERK MAPK mediante la activación de la proteína RAF.

En este estudio se demostró la probable asociación de hsa-miR-143-3p en el mantenimiento de CESC a través de la regulación negativa de proteínas clave involucradas en la señalización de Wnt y MAPK utilizando células epiteliales limbales primarias cultivadas en sistemas de cultivo 2D y 3D. Son esenciales más estudios funcionales para confirmar si los genes predichos son los objetivos directos de hsa-miR-143-3p y su papel en el mantenimiento de la potencia.

El conjunto de datos generado y analizado durante el estudio actual está disponible en el repositorio de figshare, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19242561.v1

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El estudio fue financiado por el Departamento de Biotecnología de la India (No. BT/PR8712/AGR/36/762/2013). Los autores agradecen al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) de la India por la beca de investigación senior (09/931(0007)/2018-EMR-I) y a la Comisión de Becas de la Commonwealth del Reino Unido por la beca de sitio dividido de la Commonwealth (INCN-2018-72) a Lavanya Kalaimani. Sr. D. Saravanan, Gerente, Rotary Aravind International Eye Bank, Madurai, India, por su valiosa ayuda en la recolección de muestras para el estudio. Sr. Manojkumar Kumaran, Departamento de Bioinformática, Fundación de Investigación Médica Aravind, Madurai, India, por su ayuda en la preparación de las figuras. Sr. Mohammed Sithiq Uduman, Departamento de Bioestadística, Aravind Eye Care System, Madurai, India, por ayudarnos con las estadísticas. Dr. R. Kumaragurupari, Bibliotecario Jefe, Aravind Eye Care System por su valiosa ayuda en el formato de referencias y la recopilación de literatura.

Departamento de Inmunología y Biología de Células Madre, Fundación de Investigación Médica Aravind, Madurai, Tamil Nadu, 625020, India

Lavanya Kalaimani, Muthukkaruppan Veerappan y Gowri Priya Chidambaranathan

Departamento de Bioinformática, Fundación de Investigación Médica Aravind, Madurai, Tamil Nadu, India

Bharanidharan Devarajan

Clínica de Córnea, Aravind Eye Hospital e Instituto de Posgrado en Oftalmología, Madurai, Tamil Nadu, India

Venkatesh Prajna Namperumalsamy

Departamento de Biotecnología, Fundación Aravind para la Investigación Médica, afiliada a la Universidad de Alagappa, Karaikudi, Tamil Nadu, India

Lavanya Kalaimani y Gowri Priya Chidambaranathan

Instituto de Oftalmología, University College London, Londres, Reino Unido

Lavanya Kalaimani y Julie T. Daniels

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Metodología, análisis e interpretación de datos, redacción de manuscritos: LK; Diseño del estudio, análisis e interpretación de datos: BD; Interpretación de datos, corrección de pruebas y recursos: VPN; Diseño de estudio, interpretación de datos, revisión: MV; Diseño de estudios, análisis e interpretación de datos, revisión: JTD; Diseño de estudios, adquisición de financiación, análisis e interpretación de datos, redacción de manuscritos: GPC

Correspondencia a Gowri Priya Chidambaranathan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kalaimani, L., Devarajan, B., Namperumalsamy, VP et al. Hsa-miR-143-3p inhibe la señalización de Wnt-β-catenina y MAPK en células madre epiteliales de la córnea humana. Informe científico 12, 11432 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15263-x

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Recibido: 18 de febrero de 2022

Aceptado: 21 de junio de 2022

Publicado: 06 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15263-x

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