Evaluación de genotipos, endosimbiontes y características clínicas de Acanthamoeba recuperada de infección ocular.

Aug 11, 2023

BMC Infectious Diseases volumen 22, número de artículo: 757 (2022) Citar este artículo

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Acanthamoeba es un patógeno emergente, famoso por su resistencia contra compuestos antiprotozoarios, desinfectantes y ambientes hostiles. Se sabe que causa queratitis, una infección corneal que amenaza la vista, es dolorosa y difícil de tratar y que a menudo se reporta entre usuarios de lentes de contacto y pacientes con traumatismo ocular. Acanthamoeba comprende más de 24 especies y actualmente se han identificado 23 genotipos (T1-T23).

Este estudio retrospectivo fue diseñado para examinar las especies y genotipos de Acanthamoeba recuperados de pacientes con queratitis por Acanthamoeba (AK), determinar la presencia de endosimbiontes en aislados oculares de Acanthamoeba y revisar las presentaciones clínicas.

En este estudio se incluyeron trece pacientes con QA confirmada por cultivo tratados en un centro de atención oftalmológica terciaria en Hyderabad, India, de febrero a octubre de 2020. Las manifestaciones clínicas, medicamentos y resultados visuales de todos los pacientes se obtuvieron de los registros médicos. Los aislados de Acanthamoeba se identificaron mediante la secuenciación del gen de la subunidad nuclear ribosómica (rns). Se evaluó la presencia de endosimbiontes bacterianos o fúngicos en los aislados de Acanthamoeba mediante ensayos moleculares, PCR e hibridación fluorescente in situ (FISH).

La edad media de los pacientes fue de 33 años (DE ± 17,4; IC 95% 22,5 a 43,5 años). Seis (46,2%) casos tenían factores de riesgo asociados a QA; cuatro pacientes tenían traumatismo ocular y dos eran usuarios de lentes de contacto. A. culbertsoni (6/13, 46,2%) fue la especie más común, seguida de A. polyphaga y A. triangularis. La mayoría de los aislados (12/13) pertenecían al genotipo T4 y uno era un T12; Se identificaron tres subgrupos T4A, T4B y T4F dentro del genotipo T4. No hubo asociación significativa entre los tipos de Acanthamoeba y los resultados clínicos. Ocho (61,5%) aislados albergaban bacterias intracelulares y uno contenía Malassezia restricta. La presencia de microbios intracelulares se asoció con una mayor proporción de infiltrados estromales (88,9%, 8/9), defecto epitelial (55,6%, 5/9) e hipopión (55,6%, 5/9) en comparación con el 50% (2/9). 4), 25% (1/4) y 25% (1/4) de casos de QA sin microbios intracelulares, respectivamente.

El genotipo T4 fue el aislado predominante en el sur de la India. Este es el segundo informe sobre el genotipo T12 identificado en un paciente con QA en la India, algo que rara vez se informa en todo el mundo. La mayoría de los aislados clínicos de Acanthamoeba en este estudio albergaban microbios intracelulares, lo que puede afectar las características clínicas de la QA.

Informes de revisión por pares

La queratitis por Acanthamoeba (AK) es una enfermedad ocular rara que representa el 2% de las infecciones corneales mundiales [1]. Sin embargo, tal vez debido al aumento en el uso de lentes de contacto y la creciente prevalencia de especies de Acanthamoeba en diferentes recursos hídricos, incluidas piscinas artificiales e incluso suministros de agua domésticos tratados [2], los casos de QA están aumentando a nivel mundial. El uso de lentes de contacto está aumentando en todo el mundo, en parte debido al desarrollo de lentes de contacto que pueden controlar la progresión de la miopía en los niños, y esto puede ponerlos en riesgo de desarrollar infecciones por AK que pueden provocar ceguera [3]. El vínculo entre la QA y el uso de lentes de contacto está firmemente establecido y el uso de lentes de contacto se asocia con casi el 90% de las infecciones reportadas [4]. Los brotes informados se han relacionado con soluciones desinfectantes para lentes de contacto ineficaces [5, 6]. El ciclo de vida de Acanthamoeba incluye un trofozoíto infeccioso y la etapa de quiste latente; este último puede seguir siendo viable durante varios años [7].

La QA es difícil de diagnosticar y existen regímenes de tratamiento eficaces muy limitados [8, 9]. Los quistes de Acanthamoeba son resistentes a los desinfectantes, los fármacos antiprotozoarios y el agotamiento de nutrientes, lo que plantea un desafío formidable para la atención del paciente [10]. Además, muchos de los medicamentos comunes para tratar las infecciones oculares no son eficaces para Acanthamoeba. Como el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes con QA son difíciles, esto puede llevar a una medicación prolongada y un tratamiento exitoso se vuelve extremadamente difícil, lo que lleva a una pérdida sustancial de la visión [11]. Se necesitan intervenciones quirúrgicas en el 30% de los pacientes con QA para controlar la enfermedad y, en casos raros, se extirpa el ojo infectado [12]. Además, los quistes de Acanthamoeba son difíciles de erradicar una vez que se ha establecido la infección, y esto puede provocar una recurrencia de la infección [13]. El diagnóstico correcto es esencial para una terapia exitosa, pero como los signos y síntomas clínicos de la QA varían y algunos son similares a otras infecciones oculares como la queratitis por el virus del herpes simple (VHS), el diagnóstico puede ser un desafío. Es probable que se receten analgésicos, antiinflamatorios y compuestos antimicrobianos generales mientras se establece el diagnóstico. El uso previo de corticosteroides tópicos antes del diagnóstico de infección corneal por Acanthamoeba se asocia con un peor resultado visual [14]. La QA con sospecha de resistencia a soluciones para lentes de contacto multipropósito y remedios antiamebanos establecidos requieren modalidades de diagnóstico sensibles con enfoques terapéuticos novedosos [15].

Según la morfología celular, que puede verse influenciada por las condiciones de cultivo y la fuente de aislamiento, Acanthamoeba spp. se clasifican en 3 grupos, siendo las cepas causantes de queratitis las que más comúnmente pertenecen al grupo II [7]. Se han identificado al menos 23 genotipos (T1-T23) basándose en la secuencia del gen ARNr 18S de Acanthamoeba y las especies que causan queratitis común, como A. castellani y A. polyphaga, son del clado T4 [16]. Los genotipos T2, T3, T5, T6, T10, T11, T12, T13, T15 y T16 también se han recuperado de pacientes con QA, aunque más raramente [17,18,19]. Las variaciones entre cepas en la secuencia del gen de la subunidad de ARNr (rns) de Acanthamoeba 18S se pueden utilizar para identificar genotipos subgenéricos [20].

Acanthamoeba es un protista heterótrofo que puede albergar bacterias, hongos y virus gigantes [21, 22]. Coinfecciones de Acanthamoeba con otros patógenos como Fusarium spp. o Pseudomonas aeruginosa se han observado en pacientes con queratitis [23]. Estas coinfecciones podrían deberse al transporte intracelular de estos patógenos dentro de la Acanthamoeba infectante. Además, Acanthamoeba puede actuar como campo de entrenamiento para que patógenos bacterianos invadan células eucariotas superiores [24]. Lo que no se sabe es cómo estos microorganismos intracelulares afectan el tratamiento y los resultados de la enfermedad de AK, pero los estudios han informado que la presencia de microbios intracelulares mejora la patogenicidad de los aislados de Acanthamoeba [25, 26]. En el presente estudio, se examinaron 13 aislados de Acanthamoeba recuperados de pacientes con AK en el sur de la India para evaluar la distribución epidemiológica de los genotipos y subgenotipos de Acanthamoeba rns y sus manifestaciones clínicas. Se evaluó la presencia de bacterias y hongos intracelulares en aislados de Acanthamoeba y se determinó si estaban asociados con los resultados clínicos de los pacientes con QA.

Se realizó un estudio de serie de casos retrospectivo hospitalario a partir de registros hospitalarios y cepas de Acanthamoeba aisladas en LV Prasad Eye Institute (LVPEI), Hyderabad, India, de febrero a octubre de 2020. Este protocolo de estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional de LVPEI. Hyderabad (LEC-BHR-R-09–21-758). En este estudio se incluyeron trece aislados de Acanthamoeba recuperados de pacientes con AK.

Durante el período de estudio, según el protocolo institucional, todos los pacientes que presentaban características clínicas de queratitis microbiana se sometieron a un examen completo con lámpara de hendidura para investigar el defecto epitelial corneal, el tamaño del infiltrado (si estaba presente), el tamaño del hipopión, la afectación de la esclerótica, ausencia/presencia de partículas extrañas y documentación del estado de los anexos oculares [27]. La investigación microbiológica de los raspados corneales incluyó la preparación de frotis para microscopía usando tinción de Gram e hidróxido de potasio con calcoflúor blanco (KOH + CFW), e inoculación en medios apropiados [5% agar sangre de oveja (BA), agar chocolate (CA), Sabouraud agar dextrosa (SDA), agar patata dextrosa (PDA), agar no nutritivo con Escherichia coli (NNA), caldo de tioglicolato y caldo de infusión cerebro corazón (BHI)]. El médico tratante realizó el frotis y la inoculación de todos los medios (como es estándar) en la lámpara de hendidura. Los medios de cultivo deshidratados fueron suministrados por HiMedia, Mumbai, India y recién preparados internamente para su uso. Las lentes de contacto con vendaje (2/13) se cortaron asépticamente en trozos pequeños y se inocularon en BA, CA, SDA, NNA y BHI en el laboratorio de microbiología. Todos los medios se incubaron aeróbicamente a 37 °C excepto SDA y PDA a 27 °C y agar chocolate que se incubó en 5% de CO2 a 37 °C. Los medios se observaron durante 14 días para detectar cualquier crecimiento. Los aislamientos de Acanthamoeba del raspado corneal de 13 pacientes se confirmaron mediante la observación de trofozoítos activos y quistes poligonales de doble pared; Los aislados confirmados se conservaron en NNA y se transportaron a la Facultad de Optometría y Ciencias de la Visión de la Facultad de Medicina y Salud de la UNSW, Sydney, Australia. La termotolerancia de los aislados se evaluó cultivando aislados a 28 °C, 37 °C, 40 °C y 42 °C. Después del aislamiento inicial, las cepas de Acanthamoeba se cultivaron axénicamente en medio de glucosa de levadura peptona (PYG) [28]. Cada placa de cultivo se controló para garantizar que no hubiera microbios extracelulares ni contaminación. Para evitar una posible contaminación, el medio de cultivo se reemplazó con PYG recién preparado cada dos días hasta que se recolectaron los trofozoítos. Además, para este estudio se utilizó una incubadora estéril separada a 32 °C.

Las cepas de Acanthamoeba se identificaron además mediante ensayo de PCR. Las células amebales cultivadas en NNA se recogieron en 500 µl de PBS 1X (NaCl 1,4 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM y KH2PO4 1,8 mM, pH 6,9) utilizando un raspador estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.). El ADN genómico (ADNg) se extrajo utilizando una solución de lisis Chelex al 10% v/v (Bio-Rad, CA, EE. UU.) en Triton X-100 al 0,1% v/v (Sigma-Aldrich) y tampón Tris, pH 8,0 (Thermo Fisher). Scientific, Bedford, EE. UU.), como se explicó anteriormente [29]. La cantidad de ADNds extraído se midió utilizando el espectrofotómetro Nano Drop UV-Vis (Thermo Fisher Scientific) y los viales de ADNg se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

La región del gen rns del ARNr 18S se amplificó en una reacción de PCR utilizando cebadores específicos del género Acanthamoeba, JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') y JDPRv (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3'), que codifican la región DF3 altamente variable y dan amplicones de ~ 450 pb [30]. Cada ensayo de PCR se realizó en 12,5 µl de DreamTaq Master Mix (ADN polimerasa, tampón DreamTaq 2X, dATP, dCTP, dGTP y dTTP: 0,4 mM cada uno y MgCl2 4 mM; Thermo Fisher Scientific), 1 µl de cada cebador (10 µM). , 6,5 µl de agua de grado molecular y 4 µl de plantilla de ADN. La amplificación por PCR se llevó a cabo en un ciclador térmico T100 de 96 pocillos (Bio-Rad, California, EE. UU.) utilizando las siguientes condiciones de ciclado térmico: 95 °C durante 5 min para la desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de amplificación (94 °C para 30 s, 56 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s) y una extensión final a 72 °C durante 10 min [31]. Las amplificaciones por PCR se observaron mediante electroforesis de alícuotas de 4 μl del producto de PCR en gel de agarosa al 1 % y las bandas de amplicones se examinaron utilizando Gel Doc XR+ con software de laboratorio de imágenes (Bio-Rad). Los amplicones positivos por PCR se enviaron al Centro Ramaciotti de Genómica (UNSW, Sydney, Australia) para la secuenciación de Sanger. Los productos de PCR se purificaron usando un kit EXOSAP-IT (Thermo Fisher Scientific) y la secuenciación se realizó con el cebador directo JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') usando la mezcla de reacción BigDye Terminator (V3.1) en el analizador de ADN 3730 (Applied Biosystems, Massachussets, Estados Unidos).

Las secuencias de nucleótidos de baja calidad se verificaron y recortaron manualmente con el software Chromas (2.6.6) (Technelysium Pty Ltd, Brisbane, Australia) [32]. Las lecturas de secuencia recortadas se publicaron en la base de datos de secuencias de nucleótidos del NCBI (BLASTn) para identificar los genotipos y especies de Acanthamoeba. Además, las cepas aisladas de Acanthamoeba se caracterizaron morfológicamente según la especie según el esquema de clasificación de Pussard y Pons [33]. Todas las lecturas de secuencia confirmadas y validadas se enviaron al repositorio de datos de secuencia de GenBank. Las secuencias de nucleótidos disponibles públicamente de los genotipos de Acanthamoeba se recuperaron del NCBI como cepas de referencia para el análisis filogenético (archivo adicional 1: Tabla S1). Las secuencias se alinearon usando el algoritmo ClustalW y se construyó un árbol filogenético usando el método de máxima verosimilitud y un enfoque bayesiano con parámetros de Kimura-2 mediante 1000 bootstraps en MEGA-X [34] y el árbol filogenético se visualizó usando el árbol interactivo de la vida (iTOLv6) [ 35].

Acanthamoeba se cultivó axénicamente y se mantuvo en PYG (glucosa de levadura peptona, pH 6,5) [36]. Todos los aislados se sembraron en pocillos separados de una placa de cultivo de 24 pocillos con medio PYG (500 µl/pocillo) y se incubaron estáticamente a 28 °C hasta que los trofozoítos formaron capas con un 90 % de confluencia en el fondo de cada pocillo. Se inocularon alícuotas de PYG en agar tripticasa de soja (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C durante 48 h. Al final de la incubación, se examinaron las placas de agar para detectar el crecimiento de bacterias. Antes de la recolección de los trofozoitos, el medio PYG se reemplazó suavemente por 1 ml de PBS que contenía gentamicina (100 μg/ml) para matar cualquier bacteria extracelular y la placa se puso sobre hielo con agitación suave para desalojar los trofozoitos adheridos. Se utilizó el reactivo TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Nueva York, EE. UU.) para toda la extracción de ADNg siguiendo el método de separación fenol-cloroformo según el protocolo del fabricante. El método se modificó ligeramente para excluir la adición de EDTA, que puede interferir con el ensayo de PCR al secuestrar iones Mg2+ [37]. Para mejorar la recuperación de ADNg, se pasaron suspensiones de células tratadas con TRIzol 10 veces a través de agujas de jeringa de 25G (BD, Nueva Jersey, EE. UU.) para lisar las células amebales.

El gen 16S rRNA (región V4) de bacterias intracelulares se amplificó utilizando el cebador 16S rRNA de eubacterias; 515Fw/806Rv: Fw (5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) y Rv (5' – GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) [38]. Se incluyeron ADN genómico de E. coli ATCC 10,798 y agua libre de nucleasa como controles positivos y negativos, respectivamente. La presencia de hongos intracelulares se evaluó utilizando cebadores directos ITS1Fw (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') específicos del hongo y ITS4Rv inverso (5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3') dirigidos a las secuencias conservadas de los ADNr 18S y 28S [39]. Se incluyó un aislado clínico de Candida albicans como control y se identificó el hongo intracelular mediante secuenciación de Sanger del amplicón de PCR.

Para visualizar las bacterias u hongos intracelulares, se realizó FISH en combinación con microscopía confocal siguiendo un protocolo previo [40]. Brevemente, se recogieron 1 ml de células amebales (> 90% de trofozoitos) cultivadas axénicamente en tubos eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 g para recolectar trofozoitos. El sedimento celular se lavó dos veces con solución salina de Page 1X y se transfirieron 30 µl de suspensión amebiana a portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina (Thermo Scientific, Braunschweig, Alemania) y se dejaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células adherentes se fijaron aplicando 30 µl de formaldehído al 4 % recién preparado (tamponado, pH 6,9) durante 25 min. Las células amebales adheridas se lavaron con 1X PBS, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (50%, 80% y 96%, 3 minutos cada una) y se secaron al aire. Las bacterias intracelulares se examinaron mediante hibridación utilizando la sonda EUB338 específica del dominio bacteriano marcada con Cy3 [41], y los hongos utilizando la sonda específica de hongo PF2 conjugada con Hex y una sonda EUK516 marcada con Cy5 (Tabla 1) [42] para el ARNr 18S eucariótico (Biómeros , Ulm, Alemania). Se mezclaron alícuotas (1 µl de 50 ng/ µl) de cada sonda con 9 µl de tampón de hibridación (Tris-HCl 20 mM, pH 7,1, NaCl 900 mM y formamida al 20 % v/v, SDS al 0,01 %) y se añadieron a la solución fijada. Células amebales en portaobjetos. La hibridación se llevó a cabo durante al menos 90 minutos a 46 °C en la oscuridad, después de lo cual los portaobjetos se enjuagaron con 20 µl de tampón precalentado (48 °C) (NaCl 180 mM, Tris/HCl 20 mM, pH 7,2 y 0,01 %. Ficha de seguridad (SDS). Luego los portaobjetos se cubrieron con 200 µL de tampón y se realizó un paso de lavado a 48 °C durante 25 min. Todos los portaobjetos se sumergieron rápidamente en agua MilliQ helada, se secaron al aire y se montaron usando Prolong Diamond Antifade con DAPI (Thermo Fisher Scientific); luego, los portaobjetos montados se dejaron curar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad antes de obtener imágenes. Se realizaron tres ensayos independientes y se visualizaron al menos 30 células huésped de amebas bajo el microscopio de escaneo láser confocal Olympus FV1200 en el Centro de microscopía óptica Katharina Gaus de la UNSW y las imágenes FISH se analizaron en ImageJ [43].

Las características demográficas y clínicas de los 13 pacientes con QA se recuperaron en una hoja de datos personalizada de los registros hospitalarios y se revisaron las siguientes características: agudeza visual (AV) inicial y final; síntomas informados; duración, tamaño y características de los infiltrados y defectos epiteliales (algunas mediciones fueron transcritas a partir de imágenes clínicas); tratamiento previo (definido como medicamentos utilizados antes de la primera presentación de pacientes en LVPEI); regímenes de tratamiento clínico y duración de la atención en LVPEI; necesidad de cirugía; resultado del tratamiento; ocupación de los pacientes; y factores de riesgo informados para AK [45].

El análisis de los datos se realizó en el software SPSS versión 26.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Las proporciones se presentaron como porcentaje y se calculó la media ± desviación estándar para los datos continuos. Se calculó un intervalo de confianza (IC) del 95% para los datos demográficos y clínicos utilizando la proporción (p) ± 1,96* SEM (error estándar de la media). Se utilizaron la exactitud de Fisher y la chi cuadrado para comparar datos demográficos y clínicos con estado endosimbionte con un nivel de significancia de valor de P <0,05 para pruebas de 2 colas.

Entre los 13 pacientes con AK, el mayor número de casos (30,8%, 4 pacientes con AK) se observó en febrero (archivo adicional 1: Fig. S1). Los pacientes procedían de seis estados diferentes de la India; cinco eran de Telangana, tres de Maharashtra, dos de Andhra Pradesh y uno de Rajasthan, uno de Uttar Pradesh y uno de Tripura (Fig. 1).

Mapa que muestra los estados de los pacientes de AK y el hospital LVPEI en India. El mapa fue creado usando ArcGIS (Esri GIS, California, EE. UU.). AP Andhra Pradesh, MA Maharashtra, RA Rajasthan, TE Telangana, TR Tripura, UP Uttar Pradesh

La identificación de las cepas de Acanthamoeba y su crecimiento a diferentes temperaturas se muestra en la Tabla 2. Siete aislados (53,8%) crecieron a 40 °C y 42 °C, lo que demuestra la termotolerancia de ciertas cepas que causan AK. La Figura 2 muestra los trofozoitos (1A y 1B) y quistes (1C-1E) de un aislado de Acanthamoeba (L-2483/20). La Figura 3 muestra la imagen en gel de agarosa de los productos de PCR de la región DF3 del gen de ADNr 18S de ameba y el ARNr 16S bacteriano. Se confirmó que todas las amebas eran Acanthamoeba, de las cuales ocho (61,5%, 8/13) albergaban bacterias intracelulares y un aislado (L-2429/20) contenía hongos. No crecieron bacterias a partir de alícuotas de PYG cultivadas en agar tripticasa de soja, lo que sugiere que es muy probable que cualquier bacteria identificada en los experimentos FISH esté localizada intracelularmente.

Estructuras de trofozoítos de Acanthamoeba (A) con acantopodios; las flechas indican proyecciones en forma de aguja en la superficie celular. B, imagen confocal de los núcleos de trofozoítos teñidos con DAPI. C, D, fases de enquistamiento de la cepa L-1326/20 desde el prequiste (C, D) hasta los quistes poligonales de doble pared (E), las flechas indican quistes poligonales de Acanthamoeba. Barra de escala, 10 µm

Imagen recortada en gel de agarosa de amplicones de PCR de aislados de Acanthamoeba y bacterias intracelulares. Las bandas se visualizaron mediante electroforesis en gel al 1%; Los pares de cebadores JDPFw/Rv y 515Fw/806Rv produjeron amplicones de ~ 450 pb y ~ 293 pb, respectivamente. Se utilizaron A. castellanii (ATCC 30868) y E. coli (ATCC 10798) como control positivo para las reacciones de PCR de ARNr 18S y ARNr 16S y como control negativo se utilizó agua libre de nucleasas. Las imágenes de gel de tamaño completo se incluyen en el archivo adicional 1 (Figs. 4 y 5).

Árbol filogenético inferido de las secuencias de ARNr 18S de aislados de Acanthamoeba. El árbol se creó utilizando el enfoque de unión de vecinos con el parámetro Kimura 2 basado en 1000 valores de arranque replicados. Los aislados de Acanthamoeba (de color azul) de este estudio formaron dos clados genotípicos principales; T4 fue el genotipo predominante (tres subgrupos: T4A, T4B y T4F) y T12 tuvo solo un aislado, “*” indica especies y genotipos de referencia del NCBI (color violeta)

Imágenes representativas del ensayo FISH que muestran bacterias intracelulares A y hongos C de aislados de Acanthamoeba. Se dispersaron bacterias con forma de bastón en todas las células amebales de la población, lo que se detectó utilizando la sonda EUB338 (L-579/20, indicada por flechas rojas). B Trofozoíto de Acanthamoeba (L-552/20) sin bacterias ni hongos intracelulares. C Se observaron grandes células fúngicas ovoides dentro de la cepa Acanthamoeba utilizando la sonda PF2 (L-2429/20, indicada por flechas amarillas). Barra de escala, 12 µm

La secuencia parcial de nucleótidos de la región DF3 del ADNr 18S de la ameba se alineó utilizando el algoritmo ClustalW y mostró la mayor variación de secuencia de nucleótidos entre cepas (archivo adicional 1: Fig. S2). El análisis filogenético de unión de vecinos de 13 aislados formó dos clados principales, y la mayoría de los aislados (12/13, 92,3%) pertenecían al genotipo T4 (L-552/20, L-1133/20, L-1257/20, L- 2482/20, L-2483/20, L-2487/20: A. culbertsoni, L-579/20, L-1326/20: A. polyphaga, L-1137/20, L-2429/20: A. triangularis, y L-604/20, L-1765/20: Acanthamoeba spp. T4) y un aislado (L-2391/20) de genotipo T12 (A. healyi; Tabla 2 y archivo adicional 1: Tabla S2). Junto con la morfología del quiste, se asignó a cada aislado la secuencia que producía el mayor alineamiento (% de identidad) con secuencias en NCBI de especies y genotipos existentes de Acanthamoeba. Para dos aislados (L-604/20 y L-1765/20), la morfología del quiste no fue obvia para una especie particular de Acanthamoeba, pero la explosión de nucleótidos del NCBI y el análisis filogenético confirmaron que ambas cepas pertenecían al genotipo T4. El genotipo T12 se detectó en un granjero de Maharashtra sin antecedentes de traumatismo ocular; Otros dos casos del mismo estado fueron infectados con el genotipo T4. Los diez aislamientos restantes de variantes T4 se recuperaron de pacientes con AK de Andhra Pradesh, Rajasthan, Telangana, Tripura y Uttar Pradesh (archivo adicional 1: mapa S1). En el clado T4 predominante, los aislados formaron tres subgrupos, T4A (1 aislado), T4B (10 aislados) y T4F (1 aislado). La secuencia de nucleótidos de los 13 aislados se depositó en GenBank con los números de acceso OK042094 a OK042106 (Tabla 2). Del genotipo T4B, 6 pacientes estaban infectados con A. culbertsoni, 2 con A. polyphaga y uno con A. triangularis o Acanthamoeba spp. Un paciente estaba infectado con T12 A. healyi y otro paciente (L-1765/20) estaba infectado con T4A Acanthamoeba spp. (Figura 4).

Entre los 13 aislados de Acanthamoeba, 9 (69,2%) fueron positivos para microbios intracelulares, ocho albergaban bacterias (Fig. 3) y un aislado (L-2429/20) albergaba el hongo Malassezia restricta (archivo adicional 1: Fig. S3). Para los ocho aislados que albergaban bacterias, se observaron bacterias intracelulares en forma de bastón en todo el citoplasma, y ​​las bacterias estaban presentes en todas las células de Acanthamoeba de la población observada. No se observaron bacterias extracelulares, como se esperaba debido al protocolo. M. restricta se observó como células verdes de forma ovalada dentro del aislado de Acanthamoeba (Fig. 5).

La duración media de los síntomas de los pacientes con QA infectados por Acanthamoeba con bacterias u hongos intracelulares fue de 43,0 ± 44,3 días en comparación con 16,5 ± 5,1 días de los pacientes infectados con Acanthamoeba libre de endosimbiontes (Tabla 3). Entre esos nueve casos de QA, seis tenían antecedentes de trauma ocular (n = 4) o uso de lentes de contacto (n = 2) y tres eran agricultores. Se observó una forma grave de QA con infiltrado estromal (88,9 %, 8/9) e hipopion (55,6 %, 5/9) en presencia de endosimbiontes amebales y cinco casos tenían tanto infiltrado estromal como hipopion. Sin embargo, estas diferencias en el infiltrado estromal (p = 0,2) y el hipopión (p = 1,0) no fueron significativamente más comunes en pacientes con QA con endosimbiontes amebales en comparación con aquellos sin endosimbiontes. Curiosamente, se observó una duración más prolongada del tratamiento médico (mediana, IQR: 75,0, 43,5–202,5 ​​frente a 30,0, 17,0–91,8 días) en pacientes sin endosimbiontes de Acanthamoeba (p = 0,2). En presencia de endosimbiontes, la proporción de pacientes con una úlcera en curación (66,6%) o una mejora en la AV final (44,4%) fue menor en comparación con aquellos sin endosimbiontes (75% y 50%, respectivamente) (p > 0,05). Dos pacientes (25%, 2/8) infectados por Acanthamoeba con endosimbiontes bacterianos habían recibido antibióticos junto con fármacos antiamebianos y las úlceras de ambos casos se resolvieron después de la medicación.

La mayoría de los pacientes con QA eran agricultores (5/13) o estudiantes (5/13) y los factores de riesgo asociados con la QA fueron traumatismo ocular (4 casos; 30,8%; IC 95% = 9,1—61,4) y uso de lentes de contacto ( 2 casos; 15,4%; IC 95% = 1,9—45,5). La QA unilateral se informó en 12 (92,3%) casos. La mayoría de los pacientes con QA tenían disminución de la visión (84,6%) como síntoma principal, seguido de dolor ocular (69,2%), enrojecimiento (69,2%), lagrimeo (53,8%) y mancha blanca en la córnea (15,4%). En 3 (23,1%) casos se observó un infiltrado en anillo típico de AK (> 4 mm). Se observó defecto epitelial en 6 casos (46,2%; 6,2 ± 1,7 mm), infiltrados estromales en 10 casos (76,9%; 5,0 ± 2,2 mm) e hipopión en 6 casos (46,1%; 1,12 ± 0,6 mm). La mediana de duración de la aparición de los síntomas fue de 20 días (RIQ = 15-30) y la agudeza visual final no mejoró en ≥ 2 líneas entre los pacientes con antecedentes agrícolas (5/5, 100%), edad > 32 años (4/6 , 80%) y pacientes que muestran síntomas de AK durante más de 20 días (3/6, 50%) (archivo adicional 1: Tabla S3). PHMB y clorohexidina fueron los tratamientos más comunes en este estudio (11 casos; 84,6%). Tres casos recibieron antibióticos, un caso antivirales y un caso antifúngicos como terapia de apoyo (38,5%); para estos no hubo mejoría (p > 0,05) en la MAVC en la presentación final en comparación con los casos tratados sólo con PHMB y clorohexidina. En general, la mediana de duración del tratamiento médico fue de 38 días (RIC = 23-90). De seis casos con tratamiento quirúrgico, 4 casos tuvieron queratoplastia penetrante terapéutica (TPK, n = 4), incluido un caso que tuvo un trasplante de membrana amniótica (Tabla 4). De los dos casos restantes, uno recibió terapia antimicrobiana fotodinámica con rosa de bengala (RB-PDAT) y uno se sometió a evisceración. Entre 6 pacientes que tuvieron que ser sometidos a cirugía ocular, el 66,7% (4/6) estaban infectados por cepas de Acanthamoeba con bacterias intracelulares.

Trece aislados clínicos de Acanthamoeba spp. de Hyderabad, India, se genotiparon y se analizaron las presentaciones clínicas asociadas con pacientes con QA. T4 fue el genotipo más común (92,3%), como se ha informado a nivel mundial [45,46,47,48]. A. culbertsoni (6, 46,2%) fue la especie predominante entre el genotipo T4, y esto se ha informado previamente en la India [45]. Un aislado recuperado de un paciente sin factores de riesgo preexistentes pertenecía al clado T12, que rara vez se ha aislado de casos de AK [19].

El estudio actual respalda que la queratitis predominante que causa el genotipo T4 también prevalece en varios estados (Andhra Pradesh, Maharashtra, Rajasthan, Telangana, Tripura y Uttar Pradesh) de la India. Hasta donde saben los autores, este es sólo el segundo informe sobre el genotipo T12 de A. healyi por infección corneal en la India [45]. Se informó un caso grave de QA causada por el genotipo T12 en Bangkok, Tailandia [19], donde el paciente tenía antecedentes de exposición a una sustancia química corrosiva y había usado agua del grifo para enjuagarse el ojo infectado. Entre las cepas T4 (92,3 %, 12/13), la mayoría fueron T4B (83,3 %, 10/12), con un aislado de T4A y T4F. Un estudio indio anterior informó 13 cepas (50%) del subgrupo T4B de 26 aislamientos, siendo otras T4A (dos aislados), T4D (10 aislados) y T4E (un aislado) [45]. T4A (38%) fue el principal subgenotipo de aislados de Acanthamoeba recuperados de pacientes chilenos con QA, seguido de T4B, T4G, T4C y T4D [46]. Entre las cepas T4, se han informado en diferentes países otras variantes de DF3 como T4E, F, G, I, J, N, O, P, V y X asociadas con infecciones corneales [46, 49, 50]. Estos hallazgos implican una diferencia geográfica entre los aislados de T4 que causan AK, pero esto requiere más investigación.

La incidencia de QA está aumentando constantemente en todo el mundo y aproximadamente el 90% de los casos están asociados con lentes de contacto en los países desarrollados [49]. Aunque el uso de lentes de contacto no se asocia comúnmente con la QA en la India y otros países en desarrollo, [45, 51] el aumento global de la miopía y el uso de lentes de contacto para prevenir la miopía, fines cosméticos y actividades deportivas han aumentado el riesgo de QA, especialmente entre los jóvenes [1]. Como se observó en el estudio actual, el trauma ocular y el contacto con suelo o agua contaminados son los principales factores de riesgo predisponentes a la infección por QA no relacionados con el uso de lentes de contacto [52,53,54]. La lesión ocular con partículas de polvo o materia vegetativa fue el factor de riesgo más común entre los pacientes con QA en el centro de China (52,1%) [55] y el sur de la India (48,7%) [52].

La AV final no mejoró en 2 o más líneas entre los agricultores (100%), los pacientes de > 32 años (80%) y los casos que mostraron síntomas de queratitis durante > 20 días (50%). Un estudio del Reino Unido también informó los peores resultados clínicos en pacientes con QA mayores de 34 años [56]. La integridad corneal se debilita con la edad y la mayor incidencia de ojos secos entre las poblaciones de mayor edad puede ser un posible factor predisponente a la forma grave de QA [9]. Un estudio previo de queratitis bacteriana por LVPEI respalda la asociación del tamaño del defecto epitelial con la pérdida de VA encontrada en el estudio actual [57]. Las profesiones de los pacientes suelen estar relacionadas con los factores de riesgo [55]. En el estudio actual, entre cinco casos con antecedentes agrícolas, cuatro (80%) tenían antecedentes de traumatismo ocular que pudo haber sido causado por materiales externos no estériles, ya que los enmarcadores están expuestos con frecuencia a actividades al aire libre y tres pacientes (75%, 3/ 5) fueron infectados por cepas de Acanthamoeba con bacterias intracelulares. Los cuatro casos tuvieron que someterse a cirugía ocular pero la agudeza visual no mejoró incluso después de la recuperación postoperatoria. El trauma ocular con objetos contaminados puede ser un vehículo ideal para la invasión de células de Acanthamoeba que conduce a una forma grave de AK. Aproximadamente el 90% de los pacientes con QA con antecedentes de lesión ocular recibieron injertos de córnea para restaurar la visión en el sur de China [58].

Entre los 13 aislados de Acanthamoeba, 8 (61,5%) poseían bacterias intracelulares y esto es muy similar al 59,4% de Acanthamoeba que poseía bacterias intracelulares en un estudio de los EE.UU. [25], pero mayor de dos a tres veces que las cepas en los EE.UU. Colección Type Culture [26] o un estudio anterior (1993) de EE. UU. que utilizó sólo técnicas de tinción tradicionales para revelar los microbios intracelulares [59]. Se han detectado bacterias intracelulares pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Legionella, Chlamydia y Mycobacterium en aislados de Acanthamoeba recuperados de casos de QA en EE. UU. [25], mientras que Rickettsiales, Mycobacterium y Parachlamydia spp. Se detectaron en cepas ATCC aisladas de hisopos nasales humanos, córnea y sedimento de lago, respectivamente [26]. Fritsche et al. [59] han observado bacterias con forma de bastones y cocos en cepas de Acanthamoeba tanto ambientales (24%) como clínicas (26%) de diferentes ubicaciones. Se ha observado la coexistencia de microbios intracelulares filogenéticamente diversos dentro de una célula de Acanthamoeba [60]; Se detectaron Aspergillus spp., P. aeruginosa y HAdV (adenovirus humano) en un aislado clínico de Acanthamoeba en Irán [61]. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe a M. restricta como un endosimbionte de Acanthamoeba. El paciente era un campesino con antecedentes de traumatismo ocular con agente químico y la úlcera corneal no se resolvió con tratamiento médico con PHMB y clorhexidina durante un mes. No se ha descrito la coinfección por Acanthamoeba y Malassezia en pacientes con QA, pero M. restricta ha causado con poca frecuencia queratitis fúngica [62]. Otros estudios han informado queratitis debido a la coinfección de Acanthamoeba con hongos como Cladosporium, Fusarium y Curvularia [23, 63, 64].

Las bacterias intracelulares de Acanthamoeba pueden potenciar el daño epitelial de la córnea, como se ha demostrado en un estudio clínico y en un modelo celular [25]. Aunque en el presente estudio no hubo diferencias significativas en las manifestaciones clínicas, la presencia de endosimbiontes bacterianos se asoció con una mayor proporción de infiltrados estromales (87,5%), defectos epiteliales (62,5%) e hipopión (50%). Según los datos actuales, para mostrar el efecto significativo de estas diferencias se utilizaron un mínimo de 54 sujetos (prueba z para la diferencia entre dos proporciones independientes; error α = 0,05, error 1-β = 0,8, puntuación z = 1,95 y proporción de asignación = 1:1) se requiere en futuros estudios (G*Power v3.1.9.7).

En el presente estudio, dos casos (25%, 2/8) afectados por Acanthamoeba con endosimbiontes bacterianos habían recibido antibióticos (ciprofloxacina y doxiciclina) junto con fármacos antiamebianos tópicos y la úlcera de ambos casos se resolvió después del tratamiento. Los casos restantes de QA con bacterias intracelulares sanaron cuando se trataron únicamente con PHMB y clorhexidina. Esto es de esperar ya que estos antisépticos también son eficaces contra las bacterias [65]. La adición de antibióticos puede ser ventajosa a la quimioterapia antiamebiana para anular los rasgos que mejoran la virulencia de las bacterias intracelulares [26]. Por otro lado, la liberación de endosimbiontes después de la muerte de un huésped amebal en una córnea comprometida puede aumentar la inflamación y empeorar los resultados clínicos. En la actualidad, no se comprende completamente si los remedios auxiliares del tratamiento antiamebiano, como los antibióticos, son efectivos en comparación con los fármacos antiamebianos solos [66] y aún no se ha explorado completamente el papel de los endosimbiontes durante las infecciones por amebas [25]. El tamaño de la muestra del presente estudio puede ser inadecuado para evaluar diferencias clínicamente significativas entre estos dos grupos. Sin embargo, como estudio de referencia con datos piloto, este estudio es valioso para fines epidemiológicos y taxonómicos de la queratitis por Acanthamoeba. Se necesitan estudios futuros para examinar el impacto de los endosimbiontes amebianos sobre la patogenicidad del huésped, la susceptibilidad a los medicamentos, el resultado clínico y los beneficios de agregar adyuvantes antibacterianos a la quimioterapia antiamebiana estándar con una cohorte más alta y un seguimiento prolongado de los pacientes con QA.

Este estudio confirma que las queratitis que causaron los aislados de Acanthamoeba fueron principalmente del genotipo T4 seguido del T12, con tres variantes subgenómicas T4A, T4B y T4F identificadas dentro del genotipo T4 predominante. No hubo asociación significativa entre las especies y/o genotipos de Acanthamoeba y el resultado clínico de un paciente. En el estudio actual, se observó una gran cantidad de cepas de Acanthamoeba con endosimbiontes y, aunque no hubo una relación clara con el resultado clínico, los endosimbiontes de Acanthamoeba pueden estar involucrados en la configuración de la virulencia, la supervivencia y la susceptibilidad a los medicamentos del huésped amebal.

Los datos clínicos de los pacientes con QA están disponibles en hojas de Excel y SPSS que pueden obtenerse del autor correspondiente previa solicitud razonable. El número de acceso de GenBank asignado a la secuencia de nucleótidos osciló entre OK042094 y OK042106 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=OK042094:OK042106[accn]).

Queratitis por Acanthamoeba

Acanthamoeba amplificador específico

Agudeza visual mejor corregida

Trifosfato de desoxinucleósido

Fragmento de diagnóstico 3

Instituto Oftalmológico LV Prasad

Polihexametileno biguanida

Gen del ARN ribosómico 18S de la subunidad pequeña nuclear

Agar no nutritivo

Hibridación in situ fluorescente

Reacción en cadena de la polimerasa

Terapia antimicrobiana fotodinámica con rosa de bengala

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Agradecemos la contribución de LVPEI, Hyderabad, India, por proporcionar cepas de Acanthamoeba y datos clínicos de pacientes con QA. BR recibió la beca de matrícula (UNSW, Sydney) para su título de doctorado, con la que completó este estudio.

El resumen preliminar de este estudio se presentó en el Foro Mundial de Microbios, del 20 al 24 de junio de 2021 (virtual) y en la Reunión Científica Anual de la Sociedad Australiana de Microbiología, del 31 de mayo al 3 de junio de 2021 (virtual), como presentación de un póster.

No se proporcionó financiación para este estudio.

Escuela de Optometría y Ciencias de la Visión, Facultad de Medicina y Salud, UNSW, Sydney, Australia

Binod Rayamajhee, Mark Willcox, Gauri Shankar Shrestha y Nicole Carnt

Centro de Microbiología Jhaveri, Centro de Investigación Ocular Prof. Brien Holden, Fundación de Investigación Ocular de Hyderabad, Instituto Ocular LV Prasad (LVPEI), Campus Kallam Anji Reddy, Hyderabad, India

Sharma Sharma

Instituto de Investigación Biomédica y de Salud Ambiental, Facultad de Ciencias de la Salud y de la Vida, Universidad del Oeste de Escocia (UWS), Paisley, PA1 2BE, Escocia, Reino Unido

Fiona L. Henríquez

Instituto de Córnea, LV Prasad Eye Institute, Banjara Hills, Hyderabad, India

Raksheeth Nathan Rajagopal y Bhupesh Bagga

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Monash, Clayton, VIC, 3800, Australia

Dinesh Subedi

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El manuscrito fue escrito gracias a contribuciones de todos los autores; conceptualización y diseño del estudio: NC, MW, FLH, BR, SS; Colección de cepas de Acanthamoeba: SS; extracción de datos clínicos: SS, RN, BB; análisis de datos clínicos: GS, BR; investigación de laboratorio y análisis de datos: BR, DS, MW, FLH, NC; redacción: preparación del borrador original: BR; y revisión y edición: MW, NC, FLH, GS, DS, SS, RNR; supervisión: NC, MW, FLH y SS. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Binod Rayamajhee.

Este protocolo de estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional de LVPEI, Hyderabad (LEC-BHR-R-09–21-758). Se obtuvo el consentimiento por escrito bien informado de todos los participantes. Este estudio se realizó de acuerdo con los principios y directrices éticos descritos en la Declaración de Helsinki.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Cepas de Acanthamoeba de referencia utilizadas en este estudio para el análisis filogenético. Tabla 2: Identificación de genotipo y especie de aislados de Acanthamoeba recuperados de pacientes con AK. Mapa 1: Mapa que muestra los estados de los pacientes con AK de diferentes estados de la India con códigos de muestra y genotipos identificados de Acanthamoeba de pacientes con AK. El mapa fue creado usando ArcGIS (Esri GIS, California, EE. UU.). Figura S1. Distribución mensual de casos de QA durante el período de estudio. Figura S2. Alineación de secuencia de la región DF3 del ADNr de Acanthamoeba 18S utilizando ClustalW. Tabla S3. Presentación clínica general de los pacientes con queratitis infectados por Acanthamoeba spp. Figura S3. Árbol filogenético inferido de la secuencia de ADNr 18S (ITS1) de hongos; El árbol se creó utilizando el enfoque de unión de vecinos con el parámetro Kimura 2 basado en 1000 réplicas de valores de arranque. Figura S4. Imagen en gel de agarosa (1%) de amplicones de PCR de 13 aislados de Acanthamoeba (ARNr 18S). El ensayo de PCR se realizó utilizando el par de cebadores JDPFw y JDPRv específicos del género Acanthamoeba que produjeron amplicones de ~450 pb. Fig. S5: Imagen en gel de agarosa (1%) de amplicones de PCR de 13 aislados de Acanthamoeba dirigidos a bacterias intracelulares. Se utilizó ARNr 16S, par de cebadores 515Fw y 806Rv (V4, ARNr 16S), lo que produjo amplicones de ~293 pb.

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Reimpresiones y permisos

Rayamajhee, B., Sharma, S., Willcox, M. et al. Evaluación de genotipos, endosimbiontes y características clínicas de Acanthamoeba recuperados de infección ocular. BMC Infect Dis 22, 757 (2022). https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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Recibido: 05 de mayo de 2022

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 29 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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