genoma

Jul 15, 2023

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5326 (2022) Citar este artículo

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Los tripanosomátidos, que incluyen los principales patógenos de humanos y ganado, son protozoos flagelados cuyos controles del ciclo celular y los mecanismos subyacentes no se comprenden completamente. Aquí, describimos una pantalla de biblioteca de interferencia de ARN de todo el genoma para detectar defectos en el ciclo celular en Trypanosoma brucei. Indujimos una eliminación paralela masiva, clasificamos la población perturbada mediante citometría de flujo de alto rendimiento, objetivos de ARNi de secuenciación profunda de cada etapa y reconstruimos digitalmente perfiles del ciclo celular a escala genómica; permitiendo también la visualización de datos mediante una herramienta online (https://tryp-cycle.pages.dev/). El análisis de varios cientos de genes que afectan la progresión del ciclo celular revela más de 100 caídas de componentes flagelares relacionadas con la endoreduplicación del genoma, evidencia de control metabólico de la transición G1-S, caídas de proteínas de unión a ARNm reguladoras del antígeno de superficie relacionadas con la acumulación de G2M y una supuesta nucleoredoxina requerida. tanto para la segregación del genoma mitocondrial como para la mitosis. Los resultados proporcionan evidencia genómica funcional integral para las maquinarias, vías y reguladores nuevos y conocidos que coordinan la progresión del ciclo celular del tripanosoma.

El ciclo celular eucariótico canónico abarca fases discretas: G1 (espacio 1), cuando la célula se prepara para la replicación del ADN; Fase S (síntesis), cuando tiene lugar la replicación del ADN nuclear; G2 (espacio 2), cuando la célula se prepara para la mitosis; y M (mitosis) cuando el ADN replicado se segrega y el núcleo se divide1. A la mitosis le sigue la citocinesis (división celular), generando dos células hijas2. Los mecanismos limitadores de tasas que facilitan el control de calidad se alivian en puntos discretos. Por tanto, las anomalías que se producen durante la progresión del ciclo celular pueden provocar un retraso o una detención del ciclo celular, para permitir que la célula resuelva la anomalía; en muerte celular, si la anomalía no se puede resolver o, entre otros resultados, en carcinogénesis. Por lo tanto, la progresión a través del ciclo celular suele estar bajo un estricto control de puntos de control; los puntos de control G1-S, fase intra S, G2-M y del huso controlan el inicio de la fase S, la progresión de la fase S, el inicio de la fase M y la progresión de la fase M, respectivamente3. Estos procesos han sido ampliamente estudiados, particularmente porque los defectos del ciclo celular son desencadenantes comunes de la carcinogénesis4. Sin embargo, nuestra comprensión de la evolución y los mecanismos del control de la progresión del ciclo celular eucariota se deriva principalmente de estudios sobre los opistocontes (incluidos animales y hongos), con relativamente menos estudios sobre eucariotas divergentes, como los tripanosomátidos1.

Los tripanosomátidos son protozoos flagelados e incluyen parásitos que causan una variedad de enfermedades tropicales desatendidas que tienen importantes impactos en la salud humana y animal. El tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, se transmite por la mosca tsetsé y causa enfermedades tanto en humanos como en animales, enfermedad del sueño y nagana, respectivamente, en todo el África subsahariana5. T. brucei ha surgido como un sistema experimental altamente manejable, tanto como parásito como organismo modelo6. Por ejemplo, el flagelo de T. brucei7 sirve como modelo para estudios sobre ciliopatías humanas8,9,10,11. Las características divergentes, compartidas con otros tripanosomátidos patógenos, como Trypanosoma cruzi y Leishmania, incluyen la glucólisis compartimentada dentro de los glicosomas12, una sola mitocondria con una estructura compleja de ADN mitocondrial conocida como cinetoplasto13 y la transcripción policistrónica de casi todos los genes14. La transcripción policistrónica generalizada y constitutiva en tripanosomátidos pone gran énfasis en los controles postranscripcionales mediante proteínas de unión a ARNm (RBP) y controles postraduccionales, que implican la fosforilación de proteínas, por ejemplo.

Los estudios que se centran en los controles del ciclo celular en T. brucei han revelado características conservadas con otros eucariotas bien estudiados, pero también características divergentes13,15. En particular, la evidencia disponible sugiere que ciertos puntos de control del ciclo celular están ausentes. Por ejemplo, la citocinesis puede ocurrir independientemente de la mitosis o la síntesis de ADN nuclear en la etapa de insecto de T. brucei16. Además, las funciones que antes se pensaba que cumplían las proteínas altamente conservadas emplean proteínas específicas de linaje o altamente divergentes en los tripanosomátidos. El complejo cinetocoro, que dirige la segregación cromosómica, es específico de tripanosomátidos, por ejemplo17, mientras que el complejo de reconocimiento de origen (ORC), implicado en el inicio de la replicación del ADN, es muy divergente18. En términos de estudios de alto rendimiento, el monitoreo del transcriptoma19 y proteoma20 durante el ciclo celular de T. brucei reveló cientos de ARNm y proteínas regulados, mientras que el análisis fosfoproteómico reveló la fosforilación dinámica de varias RBP21. Sin embargo, la divergencia presenta importantes desafíos pendientes, ya que a muchos genes de T. brucei aún no se les ha asignado una función específica y es probable que aún queden por identificar muchos reguladores del ciclo celular. Se pueden utilizar pantallas genéticas funcionales de alto rendimiento a escala del genoma para evaluar simultáneamente cada gen de un genoma para determinar su función en un proceso particular. Desarrollamos la secuenciación de objetivos de interferencia de ARN (RIT-seq) para T. brucei22 y generamos previamente perfiles de aptitud a escala genómica, lo que facilita las predicciones de esencialidad y la priorización de posibles objetivos farmacológicos23.

Aquí, describimos una pantalla RIT-seq a escala del genoma para identificar controles y reguladores del ciclo celular en el torrente sanguíneo de los tripanosomas africanos. Después de la inducción de la eliminación, las células se clasificaron según su contenido de ADN mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las poblaciones clasificadas fueron las etapas del ciclo celular G1, S y G2M, así como poblaciones de células perturbadas con menos ADN del que normalmente se encuentra en G1 o más ADN del que normalmente se encuentra en G2M. Se llevó a cabo un análisis RIT-seq para cada población clasificada y los perfiles del ciclo celular se reconstruyeron digitalmente para cada eliminación mediante recuentos de lectura de secuenciación. Esta exploración de todo el genoma revela los complejos proteicos, las vías y los factores de señalización necesarios para los pasos progresivos a través del ciclo celular del tripanosoma. Por ejemplo, se ha demostrado que las enzimas glicolíticas son necesarias para la progresión de G1/S, los componentes del complejo CMG (Cdc45-MCM-GINS) son necesarios para la replicación del ADN, los componentes del complejo proteasoma y cinetocoro son necesarios para la progresión de G2M, y Se ha demostrado que para la citocinesis se requieren componentes flagelares y factores de iniciación de la citocinesis. Se seleccionaron dos resultados para una mayor validación, uno de los cuales se muestra como una supuesta nucleoredoxina regulada por el ciclo celular involucrada en la coordinación de la segregación del cinetoplasto mitocondrial y el genoma nuclear.

La forma del torrente sanguíneo T. brucei se cultiva fácilmente en cultivos celulares, con proliferación exponencial y un tiempo de duplicación de aproximadamente 6,5 h. El genoma nuclear de T. brucei suele ser diploide, de modo que las células G1 tienen un contenido de genoma de 2 C; C representa el contenido de ADN haploide. Las células que progresan a través de la fase nuclear S y replican su ADN tienen un contenido de genoma entre 2 C y 4 C, mientras que las células que han completado la replicación del ADN (G2M) tienen un contenido de ADN de 4 C (Fig. 1a). La mitosis y la citocinesis producen luego dos células hijas con un contenido de ADN 2 C. Algunas perturbaciones producen defectos que implican un "cortocircuito", mediante el cual se omiten la fase S, la mitosis y/o la citocinesis, produciendo células sub-2C o células poliploides (>4 C) sobrerreplicadas (Fig. 1a). Las células poliploides surgen debido a la endoreduplicación, rondas adicionales de replicación del ADN sin citocinesis, ya sea con24 o sin25,26 mitosis, dando lugar a células con múltiples núcleos o con núcleos poliploides, respectivamente.

una representación esquemática del ciclo celular de T. brucei en el torrente sanguíneo, que también muestra fenotipos aberrantes sub-2C y >4 C (múltiples núcleos); Los zoides anucleares no se muestran porque son indetectables mediante RIT-seq. b El esquema ilustra la pantalla RIT-seq; inducción paralela masiva de ARNi con tetraciclina (Tet), seguida de citometría de flujo y RIT-seq, lo que permite la reconstrucción de los perfiles del ciclo celular, utilizando lecturas mapeadas de cada caída. Cada perfil de mapeo de lectura abarca el gen de interés y las regiones no traducidas asociadas presentes en el ARNm afín. Los datos de la biblioteca representan la población no inducida y sin clasificar. Los GeneID, Tb927.7.3160, por ejemplo, se indican sin el común 'Tb927'. componente.

Diseñamos una pantalla de secuenciación objetivo de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento (RIT-seq) para identificar controles y reguladores del ciclo celular a escala genómica. Las características clave del cribado RIT-seq incluyen: primero, el uso de una biblioteca de ARNi de T. brucei de alta complejidad que comprende, en este caso, aproximadamente un millón de clones; en segundo lugar, expresión masiva paralela inducible por tetraciclina de ARNbc afín; y tercero, secuenciación profunda, mapeo y recuento de lecturas mapeadas derivadas de fragmentos objetivo de ARNi22. Cada clon de la biblioteca tiene uno de aproximadamente 100 000 fragmentos diana de ARNi diferentes (250 a 1500 pb) entre promotores del fago T7 inducibles cabeza a cabeza. Esto se logra dirigiendo cada casete a un locus cromosómico único y específico que admita una expresión inducible sólida y reproducible22,27. Luego, la maquinaria de ARNi nativa procesa el ARNbc largo expresado induciblemente a ARNip28. La complejidad y la profundidad de la cobertura del genoma en la biblioteca son fundamentales, ya que fenotipos similares producidos por múltiples clones con distintos fragmentos objetivo de ARNi contra el mismo gen proporcionan validación cruzada. Las mejoras en la anotación del genoma de referencia29, la tecnología de secuenciación de próxima generación y las herramientas de análisis de datos de secuencia (ver Métodos) también han facilitado en gran medida el análisis fenotípico cuantitativo utilizando datos de secuencia de lectura corta.

Brevemente, indujimos una eliminación paralela masiva en una biblioteca de ARNi de forma asincrónica del torrente sanguíneo de T. brucei durante 24 h, fijamos las células, teñimos su ADN con yoduro de propidio (PI) y luego utilizamos la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para dividir la célula perturbada. población en; grupos subdiploides (<2 C), G1 (2 C), S (entre 2 C y 4 C), G2M (4 C) y sobrerreplicados (>4 C) (Figura complementaria 1). La fijación y la tinción con el tinte intercalante de ADN fluorescente se optimizaron previamente para una clasificación de alto rendimiento (consulte Materiales y métodos). Se recolectaron aproximadamente 10 millones de células para cada uno de los grupos G1, S y G2M y las muestras de estos grupos se verificaron después de la clasificación para evaluar su pureza (Fig. 1b, Fig. 1 complementaria). Para los grupos <2 C y >4 C perturbados y menos abundantes, se recolectaron menos de un millón de células; Estos grupos se conservaron en su totalidad para el análisis RIT-seq.

RIT-seq se llevó a cabo para los controles de biblioteca no clasificados, no inducidos e inducidos, y para cada uno de los cinco grupos de células inducidas y clasificadas como se describe en la sección Métodos. Brevemente, extrajimos ADN genómico de cada muestra, amplificamos fragmentos de ADN que contienen cada fragmento objetivo de ARNi en reacciones de PCR (Figura 1 complementaria) y utilizamos los productos amplificados para generar bibliotecas de secuenciación de Illumina. El análisis de las lecturas de secuenciación asignadas al genoma de referencia arrojó recuentos tanto de las lecturas totales como de las lecturas que contienen el código de barras (GTGAGGCCTCGCGA) que flanquea cada fragmento objetivo de ARNi; la presencia del código de barras confirmó que las lecturas se derivaron de un fragmento objetivo de ARNi específico y no de otra parte del genoma. Obtuvimos recuentos de lecturas asignadas a cada una de> 7200 secuencias de genes no redundantes en los controles de biblioteca no inducidos e inducidos y sin clasificar y en cada una de las cinco muestras clasificadas. Seleccionamos el punto de tiempo de 24 h, equivalente a aproximadamente 3,5 tiempos de duplicación de la población, para el análisis actual. Encontramos que las lecturas del 23,4% de los genes disminuyeron >3 veces después de 72 h de eliminación en nuestro estudio anterior RIT-seq23, mientras que las lecturas de solo el 0,6% de los genes disminuyeron >3 veces después de 24 h de eliminación en el muestras de control sin clasificar analizadas aquí (consulte la Fig. complementaria 2a, b). Por lo tanto, 24 h deberían haber permitido tiempo suficiente para el desarrollo de fenotipos inducibles robustos y también capturar células perturbadas antes de que disminuyeran críticamente debido a la pérdida de aptitud. Una característica imprevista que surgió de este análisis de datos anteriores de RIT-seq fue que la eliminación de proteínas asociadas con la replicación del ADN generalmente no lograba registrar una pérdida importante de aptitud física (Figuras complementarias 2a, b). Esto sugirió que se puede tolerar una tasa reducida de replicación del ADN, aunque se extiende la fase S (ver más abajo) pero tiene un impacto relativamente pequeño en la viabilidad. Cada biblioteca de muestras ordenada arrojó entre 23 y 37 millones de pares de lectura mapeados; <2 C = 37 M, G1 = 35 M, S = 30 M, G2M = 23 M, > 4 C = 25 M; este conjunto de cinco muestras arrojó datos para> 7000 genes, lo que equivale a> 35 000 puntos de datos de ARNi (datos complementarios 1).

Los datos digitales RIT-seq para genes individuales después de la eliminación proporcionaron una medida de abundancia en cada grupo y, por lo tanto, se utilizaron para reconstruir digitalmente perfiles del ciclo celular para la eliminación de genes individuales (Fig. 1b). Esperábamos observar la acumulación de caídas particulares en grupos específicos de fases del ciclo celular, lo que reflejaría defectos específicos. Este fue efectivamente el caso, y se muestran algunos ejemplos para ilustrarlo; sin defecto importante, G2M sobrerrepresentado o >4 C sobrerrepresentado, luego de la caída (Fig. 1b). Estos resultados sugieren que la pérdida de una cadena pesada de dineína citoplásmica (7.3160) no perturba la distribución del ciclo celular; que se requiere el proteosoma para completar G2M (ver más abajo); y esa caída de una cadena pesada de dineína axonemal flagelar (11.11220) da como resultado una endoreduplicación en ausencia de citocinesis; Las dineínas son proteínas motoras del citoesqueleto que se mueven a lo largo de los microtúbulos o impulsan el deslizamiento de los microtúbulos para producir un latido flagelar, por ejemplo30.

El genoma central de T. brucei comprende un conjunto no redundante de más de 7200 secuencias codificantes de proteínas, para las cuales ahora pudimos reconstruir digitalmente los perfiles del ciclo celular después de la eliminación. Primero, examinamos las caídas que informaron una representación excesiva de> 4 células C, lo que indica endoreduplicación, que produjo 284 genes (Fig. 2a, panel izquierdo; Datos complementarios 1). El fenotipo >4 C se observó previamente después de la eliminación de la α-tubulina en un estudio histórico que describió por primera vez el ARNi en T. brucei24 y, de hecho, observamos una sobrerrepresentación pronunciada de células >4 C para las eliminaciones de los genes de la α-tubulina y de la β-tubulina adyacentes. (Fig. 2a, panel central y derecho). Luego examinamos las caídas que informaron una representación excesiva de <2 células C, lo que indica un contenido de ADN reducido, lo que produjo 10 resultados (Fig. 2b, panel izquierdo; Datos complementarios 1). Se observaron previamente células haploides después de la eliminación del gen DOT1A y, de acuerdo con el informe anterior, observamos una representación excesiva pronunciada de <2 células C para la eliminación del gen DOT1A (Fig. 2b, panel central y derecho); No conocemos otras caídas que produzcan un fenotipo similar. De hecho, otros 'aciertos <2 C' codifican principalmente pequeñas proteínas hipotéticas, siete de las cuales son 73 ± 11% más cortas que el promedio, lo que es consistente con un recuento de lecturas bajo y un muestreo insuficiente para estos aciertos (Figura complementaria 2c). Los dos resultados restantes son una chaperona de histona (ASF1B) y una enzima glicolítica (PFK). En conjunto, estos resultados proporcionaron una validación inicial para los componentes >4 C y <2 C de la pantalla.

a El gráfico de la izquierda muestra en rojo las caídas sobrerrepresentadas en el experimento >4 C; aquellos con lecturas en el grupo >4 C que excedieron el valor medio de cambio en >1,75 veces la DE, equivalente a >1,117 veces la suma de lecturas en las muestras G1, fase S y G2M combinadas. El perfil de mapeo de lectura y los recuentos de lectura de tubulina α/β se muestran a la derecha. b El gráfico de la izquierda muestra en naranja las caídas sobrerrepresentadas en el experimento sub-2C; aquellos con lecturas en el grupo sub-2C que excedieron el valor medio de cambio en >1,75 veces la DE, equivalente a >4 veces la suma de lecturas en las muestras G1, fase S y G2M combinadas. El perfil de mapeo de lectura y los recuentos de lectura para DOT1A se muestran a la derecha. c El gráfico de RadViz muestra caídas que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados en las categorías G1 (púrpura), fase S (verde) o G2M (azul). d Perfiles de mapeo de lectura y recuentos de lectura relativos, por ejemplo, visitas. PCNA, antígeno nuclear de células proliferantes; PPL2, tipo PrimPol 2. e El diagrama de Venn muestra la distribución de derribos sobrerrepresentados en cada brazo de la pantalla.

A continuación, centramos nuestra atención en las caídas que informan una sobrerrepresentación de células G1, fase S o G2M. Los grupos de caídas que registraron recuentos de lecturas sobrerrepresentados> 25% en cada una de estas categorías se resaltan en el gráfico RadViz en la Fig. 2c (consulte también los datos complementarios 1) y los datos para un ejemplo de cada categoría se muestran en la Fig. 2d; la enzima glicolítica, aldolasa, informó un aumento del 104 % en las células G1 (más detalles a continuación); el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), una abrazadera deslizante del ADN que es un componente central de la maquinaria de replicación32, informó un aumento del 25 % en las células de la fase S y del 13 % en las células G2M, en concordancia con análisis previos33; y PrimPol-like 2 (PPL2), una polimerasa de translesión posterior a la replicación, informó un aumento del 65 % en las células G2M, lo que también coincide con análisis previos34. Estos resultados proporcionaron una validación inicial para los componentes G1, fase S y G2M de la pantalla. Se puede buscar y explorar el conjunto de datos completo utilizando una herramienta interactiva de visualización de datos en línea de acceso abierto (consulte la Figura complementaria 3; https://tryp-cycle.pages.dev/).

En general, los cinco componentes de la prueba arrojaron 1.198 genes que registraron un defecto en el ciclo celular, según los umbrales aplicados anteriormente. Esto es el 16,6% de los 7205 genes analizados, y las distribuciones de estos genes entre los cinco brazos de la pantalla se muestran en el diagrama de Venn de la Fig. 2e. Dado que predijimos que las caídas asociadas con un defecto del ciclo celular tenían más probabilidades de registrar también un defecto de crecimiento, comparamos estos conjuntos de datos con datos anteriores de perfiles de aptitud de RIT-seq23. Todos los grupos de genes que registraron defectos en el ciclo celular, excepto el pequeño conjunto <2 C, se enriquecieron significativamente en genes que previamente registraron un fenotipo de pérdida de aptitud luego de la caída en las células del torrente sanguíneo (prueba de χ2; <2 C, p = 0,93; G1, p = 0,04; fase S, p = 1,3−4; G2M, p = 1,3−23; >4 C, p = 9,4−213), consistente con la pérdida de aptitud física como resultado común después de una celda Defecto de progresión del ciclo. En conjunto, los análisis anteriores proporcionaron validación para el enfoque de fenotipado del ciclo celular basado en RIT-seq y produjeron> 1000 proteínas candidatas que impactan la progresión a través de pasos específicos del ciclo celular de T. brucei.

En la forma sanguínea de T. brucei, pueden surgir >4 células C defectuosas debido a endoreduplicación sin citocinesis, ya sea con24 o sin25,26 mitosis. Los defectos de endoreduplicación se observaron previamente después de la eliminación de la α-tubulina24 o de las proteínas flagelares7,35; consistente con la opinión de que el latido flagelar es necesario para la citocinesis en el torrente sanguíneo de T. brucei. Como se muestra arriba, las caídas de la cadena pesada de dineína (ver Fig. 1b), α-tubulina y β-tubulina (ver Fig. 2a) se encontraban entre las 284 caídas sobrerrepresentadas en el grupo endoreduplicado en nuestra pantalla. Se evaluaron las anotaciones de ontología genética (GO), que proporcionan descripciones estructuradas de productos genéticos en términos de funciones, procesos y compartimentos, para perfilar mejor esta cohorte de caídas. Los términos sobrerrepresentados en asociación con un defecto de endoreduplicación incluyeron "dineína", "transporte intraflagelar" (IFT), "axonema" y "citoesqueleto", y también "complejo T de chaperonina", "citocinesis" y "ciclo celular" (Fig. 3a). ). El gráfico del violín en la Fig. 3b muestra un enriquecimiento específico de IFT y caídas de dineína en asociación con endoreduplicación. Los componentes del exociste, principalmente involucrados en la exocitosis36, se incluyeron como cohorte de control ya que ninguno de los componentes del exociste registró enriquecimiento en el grupo >4 C, ni en ningún otro grupo experimental analizado aquí (ver más abajo). En la figura 3c se ilustra el enriquecimiento de los componentes individuales del complejo T de chaperonina, las dineínas y los factores IFT en el grupo> 4 C. El complejo T de chaperonina está involucrado en el plegamiento de tubulina y actina y, en particular, la caída de actina también se asoció con endoreduplicación (Figura 4 complementaria).

a El gráfico de barras muestra términos de ontología genética enriquecidos asociados con >4 aciertos de C, aquellos que exceden el valor medio de cambio en este conjunto en >1,75 veces la DE. Los valores p se muestran a la derecha. b El gráfico del violín muestra recuentos de lecturas relativos >4 C para cohortes de genes y refleja la distribución de los datos. Los círculos abiertos indican valores medianos y las barras verticales indican intervalos de confianza del 95%. Las cohortes significativamente sobrerrepresentadas se indican en rojo. c Los gráficos muestran la sobrerrepresentación de los factores del complejo T, la dineína y el transporte intraflagelar (IFT) en rojo en el experimento >4 C. d Los mapas de calor muestran una representación relativa en los cinco grupos ordenados para las cohortes de caídas anteriores y adicionales; azul, el más sobrerrepresentado. e Ejemplos de perfiles de mapeo de lectura para visitas sobrerrepresentadas en el grupo >4 C. f Ejemplos de perfiles de mapeo de lectura para aciertos asociados con la ciliopatía sobrerrepresentados en el grupo >4 C. Componente CMF de flagelos móviles, cilios CFAP y proteína asociada a flagelos.

El mapa de calor en la Fig. 3d muestra los datos de los cinco grupos clasificados para las cohortes descritas anteriormente y para cohortes adicionales de caídas enriquecidas en el grupo >4 C; estos incluyen cadenas de dineína adicionales, proteínas de radios radiales, proteínas de bastones paraflagelares (PFR) extraaxonemales y nucleoporinas. La galería de la Fig. 3e muestra ejemplos de perfiles de mapeo de lectura RIT-seq para veintiséis genes individuales que registran un enriquecimiento> 4 C después de la eliminación. Además de las categorías anteriores, estas incluyen la dineína 5-138 del brazo interno, las proteínas FAZ que median la unión del flagelo al cuerpo celular39; los cuatro factores de iniciación de la citocinesis CIF1-440 y los componentes del complejo pasajero cromosómico, incluidos CPC1 y la quinasa Aurora B, AUK1. AUK1 y CPC1 están asociados al huso y regulan la mitosis y la citocinesis26,41. En particular, la endoreduplicación se informó anteriormente después de la eliminación de AUK1 en el torrente sanguíneo en forma de T. brucei42 y esta es la quinasa con la sobrerrepresentación más pronunciada en nuestro conjunto de datos >4 C. La siguiente quinasa >4 C sobrerrepresentada es la CMGC/RCK (Tb927.3.690), cuya eliminación anteriormente produjo un sorprendente defecto de citocinesis43.

Ejemplos adicionales de genes que registran una sobrerrepresentación de >4 C incluyen la proteína de rueda de carro del centríolo SAS644, la proteína de localización de surcos de escisión FRW145, la proteína de la zona de transición del cuerpo basal-axonema TZP12546 y la proteína del cuerpo basal BBP24847. En la figura complementaria 4 se muestran cien ejemplos adicionales, que incluyen dineínas de cadena ligera e intermedia, otros factores asociados al flagelo, proteínas de radios radiales, componentes de flagelos móviles, proteínas de unión del flagelo y de la zona de transición, cinesinas48,49, nucleoporinas50 y muchos ejemplos anteriores. proteínas hipotéticas no caracterizadas. Algunos otros ejemplos notables incluyen la katanina KAT8051 que corta los microtúbulos, el factor regulador de dineína tripanina52, la proteína asociada a los microtúbulos AIR953, CAP51V54 y la importina, IMP155.

Los ortólogos de varias proteínas flagelares de T. brucei se han relacionado previamente con ciliopatías humanas debilitantes, de modo que el flagelo del tripanosoma se explota como modelo para estudios sobre estos defectos7. Los defectos en el transporte de dineína intraflagelar están asociados con infecciones respiratorias, por ejemplo9. Los ortólogos de DNAH (10.5350 y 11.8160, Fig. 3e) están vinculados a la infertilidad masculina, mientras que en la Fig. 3f y en la Fig. 4 complementaria se muestran ortólogos adicionales asociados a la ciliopatía que registran una sobrerrepresentación en el grupo >4 C. Estos incluyen ortólogos de proteínas. vinculado a discinesia ciliar primaria (DNAH5, DNAH11, RSPH4 y DNAI1)11; infertilidad masculina (PF16, PACRGA, CFAP43 y CMF7/TbCFAP44)7,10; y distrofias de conos-bastones, así como otros defectos oculares (CMF17, CMF39 y CMF46)8.

A partir del análisis de las caídas sobrerrepresentadas en el grupo> 4 C, llegamos a la conclusión de que la detección RIT-seq proporcionó una identificación completa a escala del genoma de los defectos de citocinesis en el torrente sanguíneo de T. brucei. La endoreduplicación parece ser un resultado común después de un defecto de citocinesis. Entre los cientos de genes necesarios para la progresión a través de la citocinesis, las proteínas flagelares ocuparon un lugar destacado, incluida la mayoría de las cadenas de dineína y los factores de transporte intraflagelares. Muchos de estos factores son esenciales para la viabilidad e incluyen posibles objetivos farmacológicos en tripanosomátidos, así como ortólogos de proteínas asociadas con ciliopatías.

Un defecto de replicación del ADN o mitosis seguido de citocinesis puede dar lugar a la generación de células que retienen ADN nuclear con un contenido de ADN inferior a 2C. Aquí enfatizamos la retención del ADN nuclear porque anteriormente se han informado células de T. brucei que carecen de ADN nuclear, denominadas zoides, como resultado de una división celular asimétrica. Los zoides se observan típicamente cuando la replicación del ADN o la mitosis se alteran en células en etapa de insecto16,25,56. El fenotipo zoide suele estar ausente o ser menos pronunciado en las células del torrente sanguíneo con desarrollo distinto57 que analizamos aquí. Sin embargo, cualquier zoide presente en el grupo <2 C no se habrá detectado utilizando RIT-seq, ya que la detección se basa en la presencia de un fragmento objetivo de ARNi nuclear.

Diez caídas estuvieron sobrerrepresentadas en el conjunto de datos de detección de <2 C RIT-seq (datos complementarios 1), incluida la histona metiltransferasa previamente identificada, DOT1A (Fig. 2b). DOT1A es responsable de la dimetilación de la histona H3K76, y la eliminación de DOT1A da como resultado mitosis y citocinesis sin replicación del ADN, generando células con un contenido de ADN haploide 31. Nuestros datos sugieren que algunas eliminaciones adicionales producen un fenotipo similar en el torrente sanguíneo de T. brucei.

A continuación, analizamos las caídas sobrerrepresentadas en los grupos G1, fase S o G2M. Varios cientos de caídas registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados en cada una de estas categorías (Fig. 2c, e). Las anotaciones GO dentro de cada cohorte revelaron una serie de términos enriquecidos (Fig. 4a). Las caídas sobrerrepresentadas se asociaron con la glucólisis, la unión del ARNm y la mitocondria en el grupo G1, con la replicación del ADN en el grupo de la fase S y con un perfil muy similar al observado para el grupo >4 C en el grupo G2M.

a Los gráficos de barras muestran términos de ontología genética enriquecidos asociados con los aciertos G1, fase S o G2M, aquellos que registran >25% de recuento de lecturas sobrerrepresentado en cada una de estas categorías. Los valores p se muestran a la derecha. b Los gráficos de violín muestran recuentos de lectura relativos de G1, fase S o G2M para cohortes de genes y reflejan la distribución de datos. Los círculos abiertos indican valores medianos y las barras verticales indican intervalos de confianza del 95%. Las cohortes sobrerrepresentadas se indican en violeta, verde y azul, respectivamente. Transporte intraflagelar IFT. c Los mapas de calor muestran una representación relativa en los cinco grupos ordenados para las cohortes de caídas anteriores y adicionales; azul, el más sobrerrepresentado. Mantenimiento del minicromosoma MCM, supresor 1 de la ADN polimerasa PSP1.

Los gráficos de violín en la Fig. 4b muestran un enriquecimiento específico de eliminaciones individuales para enzimas glicolíticas y un subconjunto de proteínas de unión a ARNm en el grupo G1, para factores de replicación de ADN en el grupo de fase S y componentes del proteosoma y un subconjunto de componentes cinetocoros en G2M. piscina (Fig. 4b). La superposición entre las caídas que se acumulan en los grupos G2M y >4 C probablemente refleja defectos de citocinesis con células que se acumulan antes y después de la endoreduplicación; compare los datos de G2M y> 4 C para factores IFT y dineínas en la Fig. 4b y la Fig. 3b, por ejemplo. Es probable que otros fenotipos perturbados por la mitosis o la citocinesis no estén asociados con una endoreduplicación sustancial; vea las cohortes de cinetocoro y proteasoma en la Fig. 4b, por ejemplo. Una vez más, el exoquiste proporcionó una cohorte de control sin componentes que registraran enriquecimiento en los grupos de fase G1, S o G2M después de la caída (Fig. 4b).

El mapa de calor en la Fig. 4c muestra los datos de los cinco grupos ordenados para las cohortes descritas anteriormente y para eliminaciones adicionales enriquecidas en la fase G1 o S (ARNt sintetasas), fase S (histonas centrales) o grupos G2M (PSP1, ADN). supresor de polimerasa 1), o no enriquecido en ningún grupo. Estos últimos conjuntos proporcionan controles adicionales que no parecen tener impactos sustanciales en la progresión del ciclo celular, incluido el complejo accesorio de edición de ARN mitocondrial MRB158 y el complejo de ATP sintasa mitocondrial V59. Por lo tanto, identificamos complejos proteicos, vías y factores reguladores que se requieren específicamente para los pasos progresivos a través del ciclo celular del tripanosoma.

A continuación, exploramos con más detalle algunas de las cohortes de resultados descritos anteriormente. Las enzimas glicolíticas son particularmente prominentes entre las eliminaciones que se acumulan en el grupo G1, e ilustramos los datos del perfil RIT-seq para estas enzimas en la Fig. 5a. Siete de once inhibiciones de enzimas glucolíticas registran una sobrerrepresentación >25% en el grupo G1; hexoquinasa, fosfofructoquinasa, aldolasa (ver Fig. 2c), triosafosfato isomerasa, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa C y piruvato quinasa. La glucólisis opera en orgánulos similares a peroxisomas conocidos como glicosomas en los tripanosomas y se cree que es la única fuente de ATP en las células del torrente sanguíneo12. La glucólisis también proporciona intermediarios metabólicos que apoyan la producción de nucleótidos. En particular, la proliferación de células de mamíferos va acompañada de la activación de la glucólisis, y el efecto Warburg se relaciona con este fenómeno en oncología60,61. De hecho, la hexoquinasa regula el punto de control G1/S en las células tumorales62. Los resultados también son consistentes con la observación de que T. brucei se acumula en G1 o G0 en condiciones que limitan el crecimiento63 o durante la diferenciación a la forma rechoncha que no se divide64, lo que posiblemente refleja un papel de la detección de glucosa en la diferenciación65. En particular, las enzimas glucolíticas están reguladas negativamente 6,7 +/-5,2 veces en las células con forma achaparrada66. Concluimos que, como en otros organismos67, existe un control metabólico del ciclo celular y un punto de restricción sensible a los nutrientes en T. brucei, con la glucólisis desempeñando un papel en la transición de la fase G1 a la S y posiblemente también en la transición G1/G0.

a El gráfico RadViz muestra la caída de enzimas glucolíticas. Se indican aquellos que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados en la categoría G1. Los puntos de datos negros indican otros genes de cada cohorte. Los puntos de datos grises indican todos los demás genes. Los perfiles de mapeo de lectura y los recuentos de lectura relativos en el panel inferior muestran resultados de ejemplo. b Como en a, pero para las caídas del factor de iniciación de la replicación del ADN que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados, principalmente en la categoría de fase S. c Como en el caso de las caídas de componentes del proteasoma que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados, principalmente en la categoría G2M. d Como en el caso de las caídas de componentes del cinetocoro que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados, principalmente en la categoría G2M.

Los factores de iniciación de la replicación del ADN son particularmente prominentes entre las eliminaciones que se acumulan en la fase S e ilustramos los datos del perfil RIT-seq para estos factores en la Fig. 5b. Cinco caídas que registran una sobrerrepresentación >25% en el conjunto de la fase S son componentes de la helicasa replicativa eucariota, el complejo CMG (Cdc45-MCM-GINS). En el centro de este complejo se encuentra el complejo de mantenimiento de minicromosomas (MCM2-7), una helicasa que desenrolla el ADN dúplex delante de la horquilla de replicación en movimiento68. La identificación de los componentes del complejo CMG sugiere que cada una de estas subunidades es necesaria para la progresión oportuna a través de la fase S.

La actividad del proteasoma promueve la mitosis en T. brucei69 y, en concordancia con esto, los componentes del proteasoma son particularmente prominentes entre las caídas que se acumulan en G2M; Ilustramos los datos del perfil RIT-seq para este complejo de proteínas en la Fig. 5c. Dieciséis de 28 caídas de componentes del proteasoma registran una sobrerrepresentación >25% en el grupo G2M. Este resultado es consistente con la opinión de que el proteosoma de T. brucei es responsable de degradar los reguladores del ciclo celular, como las ciclinas poliubiquitinadas, algunas de las cuales se sabe que controlan los puntos de control del ciclo celular en T. brucei. Los objetivos candidatos en T. brucei incluyen: CIF1, AUK170, ciclina 6 (CYC6), cuya degradación es necesaria para la mitosis71; CFB2 similar a ciclina, necesario para la citocinesis72; y ciclina 2 (CYC2) o ciclina 3 (CYC3), que tienen vidas medias cortas y un motivo de caja de destrucción candidato en el caso de CYC373.

Los componentes del cinetocoro también se encuentran entre las eliminaciones que se acumulan en G2M e ilustramos los datos del perfil RIT-seq para este complejo proteico en la Fig. 5d. Aunque la eliminación de KKT2, una supuesta quinasa, registró una sobrerrepresentación en el grupo de fase S, las eliminaciones de KKT1, KKT7 y KKT10/CLK1 registraron >25% de sobrerrepresentación en el grupo G2M, lo que sugiere que estos componentes cinetocoros particulares, que muestran patrones temporales de fosforilación de De la fase S a G2M21, se requieren para la progresión a través de la mitosis. En particular, KKT10 es una quinasa responsable de la fosforilación de KKT7, que es necesaria para la transición de metafase a anafase74; así como para la fosforilación de KKT1 y KKT2, a su vez necesarios para el ensamblaje del cinetocoro75,76. Estos hallazgos son consistentes con la opinión de que los componentes del cinetocoro controlan un punto de control del huso no canónico en los tripanosomas74.

La transcripción policistrónica generalizada en tripanosomátidos pone gran énfasis en los controles postranscripcionales y, de acuerdo con esto, las eliminaciones sobrerrepresentadas en los grupos G1, S y G2M revelaron muchas supuestas proteínas de unión a ARNm (RBP) y quinasas. De hecho, las RBP se enriquecen significativamente entre las eliminaciones que registraron defectos del ciclo celular G1, fase S o G2M (prueba de χ2, p = 7-5). Mostramos los datos del perfil RIT-seq para once eliminaciones de RBP que registran una sobrerrepresentación> 25% en estos grupos (Fig. 6a). Estos incluyen derribos para RBP10 y RBP29 enriquecidos en G1; RBP10, en particular, se ha caracterizado con cierto detalle y promueve el estado de forma del torrente sanguíneo77. Las eliminaciones de ZC3H1178, ZC3H41 y ZC3H2879 se enriquecieron en G1, fase S y G2M, respectivamente, mientras que las eliminaciones de CFB2, MKT1 o PBP1, todas recientemente vinculadas a una variante del control de expresión de glicoproteínas de superficie80,81, se enriquecieron en G2M. De hecho, con base en los resultados de la pantalla actual, priorizamos estos últimos tres PBR para el análisis de seguimiento en un estudio separado; los tres fueron así validados como hits de G2M80. Por lo tanto, la evaluación del ciclo celular RIT-seq implicó una serie de RBP específicos en el control postranscripcional de la progresión del ciclo celular a través de la modulación de la estabilidad y/o traducción del ARNm.

a El gráfico de RadViz muestra la eliminación de proteínas de unión a ARNm (RBP). Aquellos que registraron >25% de recuentos de lecturas sobrerrepresentados en las categorías G1, fase S o G2M se indican en morado, verde y azul, respectivamente. Los perfiles de mapeo de lectura y los recuentos de lectura relativos en los otros paneles muestran resultados de ejemplo. b Como en a, pero para las caídas de proteína quinasa, con quinasas seleccionadas indicadas. c Como en a pero para hipotéticas caídas de proteínas (conservadas).

Mostramos los datos de las proteínas quinasas anteriores, vinculados a fenotipos enriquecidos >4 C (Fig. 3d), fase S o G2M (Fig. 5d), y ahora mostramos los datos del perfil RIT-seq para cinco eliminaciones de proteínas quinasas adicionales que registran >25 % de sobrerrepresentación en los grupos G1, fase S o G2M (Fig. 6b). Entre ellos destacan las caídas de CRK7, ligadas a la acumulación en G1; MAPK5, vinculada a la acumulación en la fase S y quinasa tipo polo (PLK) y quinasa 3 relacionada con cdc2 (CRK3), vinculada a la acumulación en G2M. Anteriormente se demostró que PLK controla la morfología celular, la entrada de surcos y la citocinesis82,83,84, mientras que se demostró que CRK3 desempeña un papel en la progresión de G2M en el torrente sanguíneo en forma de T. brucei43,85. La correspondencia general también fue excelente con una prueba previa de ARNi de todo el kinoma43. Por ejemplo, ocho de las nueve quinasas relacionadas con un defecto de mitosis en esa pantalla también informaron un aumento (21 ± 12%) en el conjunto de G2M en la pantalla actual.

Finalmente, analizamos genes que codifican proteínas anotadas como hipotéticas (conservadas). A pesar del excelente progreso en la anotación del genoma, el 35% de los genes no redundantes en T. brucei conservan esta anotación, lo que representa> 2500 genes. Mostramos datos para varias caídas de proteínas hipotéticas arriba, relacionadas con el fenotipo enriquecido >4 C (Figura 4 complementaria), y aquí identificamos >300 caídas de proteínas hipotéticas adicionales que registran una sobrerrepresentación >25% en los grupos de fase G1, S o G2M. . Los datos de perfiles RIT-seq se muestran para cinco ejemplos en la Fig. 6c y para varios ejemplos adicionales en la Fig. 5 complementaria. Entre otros ejemplos de eliminaciones que se muestran en la Fig. 5 complementaria, se encuentran la oxidasa86 alternativa, vinculada al enriquecimiento de G1; cinesinas vinculadas al enriquecimiento de G2M, incluidas las cinesinas del complejo pasajero cromosómico (KIN-A y KIN-B)26 y KIN-G; CYC625,87, centrina 388 y, finalmente, ambos componentes del complejo chaperona de histonas FACT (facilita la transcripción de la cromatina)89 Spt16 y Pob3, vinculados al enriquecimiento de G2M. En particular, el complejo FACT se ha relacionado con la función del centrómero en células humanas90.

Los factores necesarios para la progresión del ciclo celular pueden estar ellos mismos regulados por el ciclo celular. Para identificar algunos de estos factores, comparamos nuestro conjunto de datos actual con datos de perfiles del ciclo celular cuantitativos del transcriptoma19, proteoma20 y fosfoproteoma21 (datos complementarios 1). Un estudio inicial de los 1198 genes que registraron un defecto del ciclo celular aquí (ver Fig. 2e) reveló un enriquecimiento significativo de los ARNm regulados por el ciclo celular (superposición = 114 de 484, χ2 p = 3,2-4) y proteínas que muestran fosforilación regulada por el ciclo celular. (superposición = 112 de 547, χ2 p = 0,025). Esto, a pesar de que los conjuntos de datos de transcriptoma y (fosfo)proteoma se derivaron del estadio de insecto T. brucei, de modo que la regulación puede diferir en las células T. brucei del torrente sanguíneo utilizadas para el análisis RIT-seq aquí.

En términos de proteínas reguladas por el ciclo celular específicas requeridas para pasos específicos de progresión del ciclo celular, múltiples enzimas glucolíticas reguladas positivamente en G1 se vincularon con la acumulación en el conjunto de G1 después de la eliminación (χ2 p = 7,9-11). Además, las proteínas reguladas positivamente en G2 y M se vincularon a la acumulación en G2M (χ2 p = 1,8-8) o >4 grupos de C (χ2 p = 8,9-9) después de la eliminación, incluidos los componentes del cinetocoro y del complejo pasajero cromosómico, respectivamente. Algunas transcripciones específicas necesarias para la progresión del ciclo celular pueden estar reguladas positivamente antes del pico de demanda de la proteína codificada, y encontramos evidencia que respalda esta opinión. Por ejemplo, las transcripciones reguladas positivamente en la fase G1 tardía o en la fase S se enriquecieron entre aquellas caídas relacionadas con la acumulación en el grupo G2M (χ2 p = 3,3-3 y p = 0,011, respectivamente); ambos componentes del complejo FACT, regulados positivamente en G1, por ejemplo (ver Figura complementaria 5). De manera similar, las transcripciones reguladas positivamente en fase S y G2M, incluidas aquellas que codifican múltiples proteínas asociadas a flagelos, se enriquecieron entre las eliminaciones relacionadas con la acumulación en el grupo >4 C (χ2 p = 4,6-18 y p = 2,4-5 respectivamente).

Algunas proteínas mostraron patrones de expresión y fosforilación regulados por el ciclo celular que eran consistentes con sus funciones en la progresión del ciclo celular. Estos incluyeron supuestos RBP de la familia del supresor de la ADN polimerasa 1 (PSP1), que muestran una regulación positiva del ARNm en G1, una regulación positiva de la proteína en la fase S, una fosforilación regulada por el ciclo celular y, después de la eliminación, una acumulación en G2M (véanse las figuras 4c y 6a). Los componentes del cinetocoro, KKT1 y KKT7, y también CRK3, muestran una regulación positiva del ARNm en la fase S, una regulación positiva de las proteínas en G2 y M, una fosforilación regulada por el ciclo celular y, después de la eliminación, una acumulación en G2M (véanse las figuras 5d y 6b); KKT10 y CYC6 informan un perfil similar (ver Fig. 5d), excepto por el componente de regulación del ARNm. Los factores de iniciación de la citocinesis, CIF1 y CIF2, muestran una regulación positiva del ARNm en la fase S, una regulación positiva de las proteínas en G2 y M, una fosforilación regulada por el ciclo celular y, después de la eliminación, una acumulación en el grupo endoreduplicado (ver Fig. 3e). Finalmente, los componentes del complejo cromosómico pasajero, CPC1 y AUK1, así como FRW1 localizado en surco, informan sobre regulación positiva de ARNm y proteínas en G2M y, luego de la eliminación, acumulación en el grupo endoreduplicado (ver Fig. 3e). Por lo tanto, varios reguladores vinculados a defectos específicos de progresión del ciclo celular mediante el perfil RIT-seq están regulados por el ciclo celular.

La prueba RIT-seq actual identificó muchos candidatos nuevos a reguladores del ciclo celular, dos de los cuales, ambos asociados con una pérdida significativa de condición física en nuestra prueba RIT-seq anterior23, se investigaron con más detalle. Primero, Tb927.10.970 se asoció con una endoreduplicación pronunciada después de la caída (Fig. 7a). La proteína predicha contiene un motivo de repetición tetratricopeptídica, un grupo de sitios de fosforilación, uno de los cuales, T706, se ha informado que está regulado por el ciclo celular, alcanzando su punto máximo en G2M21 tardío, y una serie de supuestos dominios IQ de unión a calmodulina (Fig. 7b). . Se demostró que Tb927.10.970 se localiza en el bastón paraflagelar en el estadio del insecto T. brucei (www.tryptag.org91,92). Para validar Tb927.10.970 como un impacto de> 4 C en los tripanosomas en forma del torrente sanguíneo, ensamblamos un par de cepas de eliminación de ARNi inducibles independientes. El análisis del crecimiento celular reveló una pérdida grave de aptitud física después de la caída, confirmada por qRT-PCR (Fig. 7c). Luego, la citometría de flujo confirmó la endoreduplicación, con picos prominentes detectados que representan células 8 C y 16 C después de la eliminación (Fig. 7d, panel izquierdo), mientras que el examen de estas células por microscopía reveló múltiples núcleos, lo que indica endoreduplicación con mitosis continua (Fig. 7d). , panel derecho).

a Lecturas mapeadas y perfil del ciclo celular reconstruido después de la caída de 10.970. b Mapa esquemático de 10.970. Motivo repetido del tetratricopéptido TPR, fosforilación de P, motivos IQ, supuestos dominios de unión a calmodulina. c El gráfico de la izquierda revela una caída eficiente inducida por tetraciclina (tet) de 10,970 después de 24 h. Se indican los valores medios y 3 réplicas técnicas, y el valor p se deriva mediante una prueba t no apareada. La curva de crecimiento de la derecha revela un grave defecto de crecimiento tras la caída. n = 2 clones biológicamente independientes y la línea indica valores medios. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d El análisis de citometría de flujo reveló endoreduplicación después de 24 h de caída de 10,970, según la tinción con yoduro de propidio. Las puertas indican las distintas etapas del ciclo celular, basándose en células no inducidas (-tet). El panel de la derecha muestra células representativas con ADN teñido con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) antes y después de la eliminación. Núcleo N, cinetoplasto K.

Luego dirigimos nuestra atención a Tb927.10.3970, anotada como "proteína hipotética, conservada" y asociada con un mayor contenido de ADN después de la eliminación (Fig. 8a). La proteína Tb927.10.3970 predicha contiene tres sitios de fosforilación regulados por el ciclo celular y un dominio similar a tiorredoxina (Fig. 8b). Se demostró que esta proteína está regulada por el ciclo celular según el análisis proteómico y se localiza en el núcleo en el estadio del insecto T. brucei20. Para explorar el papel de Tb927.10.3970 en los tripanosomas en forma del torrente sanguíneo, ensamblamos un par de cepas independientes de eliminación de ARNi inducibles. El análisis del crecimiento celular reveló una pérdida grave de aptitud física después de la caída, confirmada mediante el seguimiento de la expresión de 10.3970 etiquetado con epítopo (Fig. 8c). La citometría de flujo confirmó un aumento en el contenido de ADN después de la eliminación y también reveló un aumento en el tamaño de las células (Fig. 8d). El examen de estas células mediante microscopía nos permitió evaluar tanto los núcleos como los cinetoplastos (genomas mitocondriales), revelando un aumento importante en la proporción de células con un solo núcleo y un único cinetoplasto redondeado después de la caída, una disposición típicamente característica de las células G1 (Fig. .8e). El análisis cuantitativo de estos compartimentos reveló un aumento pronunciado en el contenido de ADN en ambos genomas después de la eliminación (Fig. 8f), lo que indica que tanto la segregación del cinetoplasto como la mitosis fallaron, mientras que la replicación del genoma pudo continuar en diversos grados, generando cinetoplastos agrandados y núcleos poliploides. Finalmente, evaluamos la localización subcelular de 10.3970 etiquetado con epítopo durante el ciclo celular en forma del torrente sanguíneo. La microscopía de inmunofluorescencia cuantitativa reveló un patrón que también se observó en células en etapa de insecto (www.tryptag.org20,91,92). 10.3970 mostró una localización nuclear, que aumentó en intensidad durante el ciclo celular y luego cayó precipitadamente en las células posmitóticas (Fig. 8g). Concluimos que 10.3970 codifica una supuesta nucleoredoxina que está regulada por el ciclo celular y es necesaria para la segregación y citocinesis del genoma mitocondrial y nuclear.

a Lecturas mapeadas y perfil del ciclo celular reconstruido después de la caída de 10.3970. b Mapa esquemático de la supuesta nucleoredoxina codificada por 10.3970. Dominio TRX similar a tiorredoxina. c Las transferencias de proteínas de la izquierda revelan una eliminación eficiente inducida por tetraciclina (tet) de 10.3970 etiquetado con myc N-terminal para un clon representativo después de 24 h. EF1α sirve como control de carga. La curva de crecimiento de la derecha revela un grave defecto de crecimiento tras la caída. n = 2 clones biológicamente independientes y la línea indica valores medios. d El análisis de citometría de flujo reveló un mayor contenido de ADN después de 24 h de eliminación de 10,3970, según la tinción con yoduro de propidio a la izquierda, y un mayor tamaño de las células, según el perfil de dispersión directa a la derecha. Las puertas en el perfil de la izquierda indican las distintas etapas del ciclo celular, basadas en células no inducidas (-tet). e Cuantificación de células con un solo núcleo y un solo cinetoplasto redondeado (1 N: 1 Kr) antes y después de 24 h de caída de 10.3970, basada en tinción DAPI y microscopía. n = 2 clones biológicamente independientes y las líneas indican valores medios; n = 80 celdas en cada caso. f Los diagramas de caja muestran la cuantificación de la intensidad DAPI de los núcleos (izquierda) y los cinetoplastos (derecha) en células con un solo núcleo y un solo cinetoplasto redondeado, antes y después de 24 h de caída de 10.3970; n = 100 en cada caso. Los datos provienen de dos clones independientes y se muestran como puntos temblorosos, el cuadro indica el IQR, los bigotes muestran el rango de valores dentro de 1,5*IQR, las líneas horizontales indican la mediana y las muescas representan intervalos de confianza del 95 %. El recuadro de la derecha muestra células representativas antes y después de la caída. N, núcleo; K, cinetoplasto. g Las imágenes representativas de microscopía de inmunofluorescencia muestran 10.3970 (verde) etiquetado con GFP N-terminal en diferentes etapas del ciclo celular, según lo definido por la configuración del núcleo (N) y el cinetoplasto (K) observada al teñir el ADN con DAPI. La intensidad de la señal GFP10.3970 se cuantificó y se muestra en el gráfico de la derecha. n = 26, 21, 5 y 6 células para G1, fase S, G2M y post-M, respectivamente. Las líneas indican la mediana. Los datos de origen para c y e–g se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A pesar del intenso interés y los estudios13,15, aún quedan por identificar muchos reguladores del ciclo celular en los tripanosomátidos y queda mucho por aprender sobre el control y la progresión del ciclo celular en estos parásitos. La tinción de ADN seguida de citometría de flujo es un enfoque ampliamente utilizado para cuantificar el contenido de ADN celular y analizar la distribución del ciclo celular en poblaciones que de otro modo serían asincrónicas. Aquí, combinamos el análisis genético de pérdida de función a escala del genoma con tinción de ADN y citometría de flujo en tripanosomas africanos del torrente sanguíneo e identificamos cientos de genes necesarios para la progresión a través de etapas específicas del ciclo celular.

La anotación funcional de los genomas de tripanosomátidos seguirá beneficiándose de nuevos análisis funcionales de alto rendimiento, y la eliminación mediada por ARNi ha demostrado ser un enfoque poderoso para T. brucei. El perfil RIT-seq proporciona datos para casi todos los genes y, utilizando este enfoque, describimos previamente datos de pérdida de aptitud a escala genómica23. Entre 3117 caídas que anotaron una pérdida significativa de aptitud en las células del torrente sanguíneo en esa prueba (42% de todos los genes analizados) estaban los genes que codificaban las 18 subunidades del complejo de transporte intraflagelar (χ2 p = 1-6), 12 de 13 dineína cadenas pesadas (χ2 p = 4-4), los 8 componentes chaperonas TCP-1 (χ2 p = 1-3), 27 de 30 nucleoporinas (χ2 p = 2-7), las once enzimas glicolíticas (χ2 p = 2 −4) y 30 de 31 subunidades del proteosoma (χ2 p = 2−9). Este conjunto también incluía 18 de 19 proteínas cinetocoras (χ2 p = 6-6), identificadas más tarde como componentes de este complejo esencial17. Con el estudio actual, ahora vinculamos muchos de estos genes, y muchos más, con defectos específicos del ciclo celular después de la eliminación del ARNi. En particular, una gran cantidad de caídas de proteínas flagelares produjeron células con exceso de ADN, lo que indica que la replicación del ADN a menudo continúa después de que no se completa la citocinesis, debido a defectos que ocurren durante la propia citocinesis o, en algunos casos, antes en el ciclo celular. Identificamos vías y complejos proteicos que impactan la progresión del ciclo celular, como la glucólisis (transición G1/S) y el proteosoma (transición G2/M). También identificamos muchas proteínas de unión a ARNm y proteínas quinasas implicadas en el control de la progresión del ciclo celular. En particular, vinculamos múltiples objetivos farmacológicos potenciales y prometedores conocidos con defectos de progresión del ciclo celular, como las enzimas glicolíticas93, el proteasoma94, las cinetocoro quinasas75,95 y otras quinasas96.

Los estudios anteriores del ciclo celular a menudo se han centrado en ortólogos de tripanosomas de reguladores conocidos de otros eucariotas. Dado que el perfilado a escala del genoma es imparcial, presenta la oportunidad de descubrir factores y reguladores divergentes y novedosos que afectan la progresión del ciclo celular. En consecuencia, vinculamos muchas proteínas hipotéticas y no caracterizadas previamente de función desconocida con defectos específicos de progresión del ciclo celular. Por lo tanto, descubrimos mecanismos con un origen antiguo en un ancestro eucariota común y otros que probablemente reflejan la biología específica de los tripanosomátidos. También comparamos nuestros datos de perfiles del ciclo celular con conjuntos de datos de transcriptoma y (fosfo)proteoma regulados por el ciclo celular.

El conjunto de datos digitales proporcionado en los datos complementarios 1 facilita un mayor interrogatorio y análisis de los datos RIT-seq del ciclo celular a escala del genoma. También hemos puesto los datos a disposición a través de una herramienta interactiva de visualización de datos en línea de acceso abierto (https://tryp-cycle.pages.dev/), que permite la búsqueda y navegación de datos (consulte la figura complementaria 3). La comparación con conjuntos de datos nuevos y existentes, incluidos datos de localización subcelular de alto rendimiento92 www.tryptag.org, debería facilitar estudios futuros. Dado que los análisis genéticos de alto rendimiento suelen producir una proporción de "aciertos" falsos positivos22, recomendamos cierta precaución, sin embargo, en particular cuando los resultados pueden ser generados predominantemente por un único fragmento RIT-seq. Por otro lado, hay caídas en el conjunto de datos actual que muestran un enriquecimiento potencialmente informativo del ciclo celular pero no superan los umbrales aplicados anteriormente. Teniendo en cuenta ambos puntos, esperamos que el conjunto de datos digitales y la herramienta en línea sirvan como recursos valiosos. Dado que otros parásitos tripanosomatidos importantes, incluidos otros tripanosomas africanos, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax; tripanosomas americanos, Trypanosoma cruzi; y Leishmania spp. comparten un alto grado de conservación y sintenia con T. brucei spp.97 los conjuntos de datos actuales también pueden ayudar e informar estudios sobre estos y otros tripanosomátidos.

Para ilustrar aún más el valor del conjunto de datos actual de RIT-seq, analizamos dos nuevos resultados de la pantalla con más detalle y revelamos el papel de una supuesta nucleoredoxina tanto en el cinetoplasto como en la segregación nuclear. De hecho, aunque la replicación del ADN continúa, las células que carecen de este factor no logran sufrir escisión o separación del cinetoplasto98, mitosis o citocinesis. La replicación y segregación del ADN mitocondrial y nuclear se coordinan durante el ciclo celular de T. brucei13 para garantizar la herencia de una única copia de cada genoma por cada célula hija, pero el mecanismo subyacente a la coordinación sigue siendo desconocido. La identificación de una proteína similar a la tiorredoxina necesaria para la segregación del ADN nuclear y del cinetoplasto sugiere que la señalización redox está involucrada en la coordinación de estos procesos. Se observó un fenotipo comparable tras la eliminación de las proteínas de unión al ADN mitocondrial y nuclear, UMSBP1 (proteína de unión a secuencia de minicírculo universal) y UMSBP2, previamente vinculadas a la replicación y segregación del cinetoplasto y del ADN nuclear en el estadio del insecto T. brucei99,100. En particular, tanto la unión al ADN como la dimerización de USMBP están reguladas por redox101. Aunque no se comprenden en detalle, los tioles de cisteína reactivos funcionan como sensores redox asociados al ciclo celular en células de mamíferos102. Por lo tanto, proponemos un papel para la supuesta nucleoredoxina actual en la reducción de tioles y la potencial interrupción de los enlaces disulfuro en uno o más reguladores clave del ciclo celular. Esta función puede conservarse entre los tripanosomátidos y, de hecho, la señalización redox puede desempeñar funciones adicionales en el control del ciclo celular, ya que nuestro análisis vinculó dos proteínas adicionales similares a la tiorredoxina con defectos específicos y distintos del ciclo celular; TRX2, una chaperona mitocondrial regulada por redox103, se relacionó con la acumulación en G1, mientras que la supuesta tiorredoxina codificada por Tb927.9.12330 se relacionó con la acumulación en G2M (Datos complementarios 1). Se necesitará más trabajo para explorar cómo el interruptor redox104 basado en tiol o los mecanismos de detección coreografían la progresión del ciclo celular en los tripanosomátidos.

En resumen, informamos defectos del ciclo celular inducidos por ARNi a escala genómica e identificamos los genes de T. brucei que subyacen a estos defectos. Los resultados confirman funciones conocidas en la progresión del ciclo celular y proporcionan anotaciones funcionales para muchos genes adicionales, incluidos muchos sin asignación funcional previa y muchos que son específicos de tripanosomátidos. Como tal, los datos no sólo mejoran nuestra comprensión de la progresión del ciclo celular en estos patógenos importantes y divergentes, sino que también deberían acelerar nuevos descubrimientos. En conjunto, nuestros hallazgos facilitan la anotación del genoma y proporcionan evidencia genética completa de los complejos de proteínas, las vías y los factores reguladores que facilitan y coordinan la progresión a través del ciclo celular del tripanosoma.

La biblioteca de ARNi de T. brucei22 del torrente sanguíneo se descongeló en HMI-11 que contenía 1 μg.ml-1 de blasticidina y 0,2 μg.ml-1 de fleomicina y se incubó a 37 °C en CO2 al 5%. Después de aproximadamente 48 h, se prepararon seis matraces, cada uno de los cuales contenía 2 x 107 células en 150 ml de HMI-11 como se indicó anteriormente; A cinco de ellos se les añadió 1 μg.ml-1 de tetraciclina, mientras que uno sirvió como control no inducido. Las células se cultivaron en estas condiciones durante 24 h. Se cultivaron células 105 de T. brucei 2T1 del torrente sanguíneo como se indicó anteriormente en presencia de 1 μg.ml-1 de fleomicina y 1 μg.ml-1 de puromicina. Estas células se transfectaron mediante electroporación como se describe22 y se seleccionaron con 2,5 μg.ml-1 de higromicina (construcciones de ARNi) o 10 μg.ml-1 de blasticidina (construcciones de etiquetado myc o GFP). La eliminación del ARNi se indujo con 1 μg.ml-1 de tetraciclina.

Las muestras de la biblioteca de ARNi se recolectaron mediante centrifugación durante 10 minutos a 1000 g. Luego, las células de cada matraz se resuspendieron en 25 ml de PBS 1x (pH 7,0) suplementado con EDTA 5 mM y FBS al 1 % (“PBS suplementado”), se centrifugaron nuevamente durante 10 minutos a 1000 g y luego se resuspendieron en 0,5 ml de PBS suplementado. A cada suspensión celular se le añadieron gota a gota 9,5 ml de formaldehído al 1 % en PBS suplementado, con agitación regular. Las células se incubaron durante 10 minutos más a temperatura ambiente y luego se lavaron dos veces en 10 ml de PBS suplementado usando centrifugación como anteriormente. Finalmente, las células se resuspendieron a 2,5 x 107 por ml en PBS suplementado y posteriormente se almacenaron a 4 °C, en la oscuridad. Las células fijadas, 3 x 108 inducidas por Tet y 107 no inducidas, se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 gy se resuspendieron en 10 ml de PBS suplementado que contenía Triton X-100 al 0,01% (Sigma Aldrich). Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 10 minutos a 700 gy se lavaron una vez en 10 ml de PBS suplementado. Luego, las células se resuspendieron en 4 ml de PBS suplementado que contenía 10 μg.ml-1 de yoduro de propidio (Sigma Aldrich) y 100 μg.ml-1 de RNasaA (Sigma Aldrich), y se incubaron durante 45 min a 37 °C. , en la oscuridad; Posteriormente, las células se mantuvieron en hielo y en la oscuridad. Inmediatamente antes de la clasificación, las células inducidas por Tet se filtraron (filtro tipo copa Filcon, malla de 50 µm, BD™ Medimachine) en tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (BD Falcon). Las células se clasificaron utilizando el clasificador de células BD InfluxTM (Becton Dickinson), con el software BD FACSortTM, en las instalaciones de citometría de flujo y clasificación de células de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Dundee. Las células se clasificaron en grupos de <2 C (~5 × 105 células), 2 C (G1, 1 × 107 células), 2-4 C (S, 1 × 107 células), 4 C (G2M, 1 × 107 células) y >4 C (~9 × 105 células) según su contenido de ADN y se recolectaron en tubos Falcon de 50 ml (BD Falcon); El tiempo total de clasificación fue de aprox. 4h. Luego, las muestras clasificadas de 2 C, 2–4 C y 4 C se procesaron en un analizador de citometría de flujo FACS LSR Fortessa para un control de calidad posterior a la clasificación. Para el análisis de las eliminaciones de Tb927.10.970 o Tb927.10.3970, se centrifugaron 1 x 107 células durante 10 minutos a 1000 g y se lavaron en PBS suplementado. Las células se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 1% en PBS suplementado, se lavaron y almacenaron a 4 °C en PBS suplementado. Las células se sedimentaron durante 10 min a 1000 gy se permeabilizaron a temperatura ambiente durante 30 min en PBS suplementado más Triton X-100 al 0,01%. Las células se lavaron una vez en PBS suplementado, seguido de centrifugación durante 10 minutos a 700 gy luego se tiñeron en PBS suplementado con 10 μg.ml-1 de yoduro de propidio y 100 μg.ml-1 de ARNasa A durante 1 hora a 37 °C. Las muestras se procesaron en un BD FACSCanto (Becton Dickinson). Se utilizó FlowJo v10.7.1 para el análisis y visualización de datos.

Los cinco grupos de células clasificadas inducidas por Tet, así como de células no inducidas o inducidas, pero no clasificadas, se lisaron durante la noche a 56 °C en 50% (v/v) de tampón AL (Qiagen) y 0,5 mg.ml-1 de Proteinasa K (Qiagen), para revertir la reticulación del formaldehído. Luego se extrajo el ADN genómico utilizando el kit de extracción de ADN de sangre y tejido DNeasy (Qiagen), según las instrucciones del fabricante, con la excepción de que cada muestra se eluyó en 50 µl de tampón AE. La muestra completa (rango = 140–840 ng) se utilizó para PCR, en una reacción de 100 μl, utilizando OneTaq (NEB), y los cebadores Lib3F (CCTCGAGGGCCAGTGAG) y Lib3R (ATCAAGCTTTGGCCTGTGAG) y con el siguiente programa: 94 °C para 4 min, seguido de 27 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 68 °C por 2 min y 10 s, y una extensión final de 68 °C por 5 min. Luego, los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de extracción de PCR Qiaquick (Qiagen), según las instrucciones del fabricante, y se eluyeron en 30 µl de agua libre de nucleasas (Ambion); dos columnas por muestra.

Los productos de PCR purificados se utilizaron para la preparación y secuenciación de la biblioteca en el Centro Tayside de Análisis Genómico de la Universidad de Dundee. Los productos de la PCR se fragmentaron utilizando un sonicador Covaris M220 (factor de trabajo del 20 %, potencia máxima/mostrada de 75 W, duración de 60 s - 3 × 20 s con paso de centrifugado intermitente hacia abajo, temperatura de 18 a 20 °C; lo que resultó en 250 a 300 pb fragmentos enriquecidos), y las bibliotecas se prepararon utilizando el kit Truseq Nano DNA Library Prep (Illumina). Las muestras se multiplexaron y secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq 500, en un cartucho de salida v2 de 150 ciclos, de extremo emparejado. Cada biblioteca se ejecutó en 4 carriles de secuenciación. La llamada de base, la deconvolución del índice, el recorte y el control de calidad se realizaron en BaseSpace utilizando el software de conversión bcl2fastq2 v2.17.

El proceso de análisis de datos de secuenciación se adaptó de22. Los archivos FASTQ con lecturas finales emparejadas directa e inversa (4 réplicas técnicas para cada muestra) se concatenaron y alinearon con el genoma de referencia v46 del clon TREU927 de T. brucei descargado de TriTrypDB29 usando Bowtie2106, con el pre-local "muy sensible". establecer la opción de alineación. Las alineaciones se convirtieron al formato BAM, se ordenaron por referencia y se indexaron con SAMtools107. La calidad de los alineamientos se evaluó con Qualimap 2108 utilizando las opciones bamqc y rnaseq. Los archivos de salida de Qualimap 2 se agregaron con MultiQC109 y se inspeccionaron. Las alineaciones se deduplicaron con el paquete de herramientas Picard utilizando la función MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard/); para minimizar el potencial de sobrerrepresentación de los fragmentos RIT-seq más cortos. Las alineaciones con lecturas emparejadas correctamente se extrajeron con la vista SAMtool usando la opción -f 2 y se analizaron con un script de Python personalizado para extraer las lecturas emparejadas que contienen la secuencia del código de barras (GTGAGGCCTCGCGA) en orientación de complemento hacia adelante o hacia atrás. La cobertura del genoma de las lecturas alineadas se extrajo de los archivos bam utilizando herramientas profundas en formato bedGraph110. La opción —scaleFactor se utilizó para normalizar cada muestra con respecto al tamaño de la biblioteca. En primer lugar, se calculó el valor medio del tamaño de la biblioteca a partir de todas las muestras. En segundo lugar, el valor medio se dividió por el tamaño de la biblioteca de cada muestra para obtener los factores de escala. Los archivos de mapeo de lectura de bedGraph se visualizaron con el paquete Python svist4get111. Los recuentos de lectura de secuencias codificantes de proteínas y regiones no traducidas asociadas (cuando estaban anotadas) se determinaron a partir de los archivos bam utilizando featureCounts112 y se normalizaron a transcripciones por millón de kilobases (TPM). La reducción de dimensionalidad de los valores TPM G1, S y G2M se realizó con el algoritmo radviz implementado en el paquete pandas python113. El script bash que contiene el proceso de análisis, un archivo de especificación del entorno conda para su ejecución, el script python para extraer lecturas de códigos de barras y un ejemplo de uso básico están disponibles en GitHub (https://github.com/mtinti/ritseq_cellcycle). Posteriormente, los datos se analizaron utilizando un conjunto GO-slim y herramientas de ontología genética disponibles a través de tritrypdb.org y se visualizaron utilizando herramientas disponibles en huygens.science.uva.nl/PlotsOfData.

Para la eliminación inducible por tetraciclina de la expresión de Tb927.10.970 o Tb927.10.3970, los fragmentos de genes se amplificaron utilizando los cebadores de PCR 970RiF (GATCGGGCCCGGTACCCGCCACACTGAACAACCTT) y 970RiR (GATCTCTAGAGGATCCTCCCTTTGCCGCCTTACCAC) o el 3970RiF (GATCGGGCCC). GGTACCGCGTCGGAGATGTGATCCTT) y 3970RiR (GATCTCTAGAGGATCCCACAACTCGCATACACGGAGG) y clonados en dos pasos en pRPaiSL 105. Las construcciones resultantes se confirmaron mediante secuenciación y se digirieron con AscI antes de la transfección. La eliminación de Tb927.10.970 se evaluó mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). El ARN se extrajo utilizando el RNeasy Mini Kit con un paso de digestión de DNasa en columna (DNasa libre de RNasa, Qiagen). El ARN (1 μg) se transcribió de forma inversa utilizando un kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific) y se utilizó el equivalente de 25 ng de ARN en cada reacción de qPCR, con los cebadores 970qRT_F (AGGAAGCGGAAGGAGAGGAT) y 970qRT_R (AGCGGAATTTATGGCTTCGC). Las reacciones se realizaron por triplicado técnico en un QuantStudio3 (Applied Biosystems) utilizando Luna® Universal qPCR Master Mix (NEB). Se utilizó TERT (Tb927.11.10190) como gen de referencia para calcular el valor de 2^-deltaCt para cada muestra. Para el etiquetado N-terminal de Tb927.10.3970, el fragmento de direccionamiento se amplificó utilizando los cebadores de PCR 3970tagF (GATCTCTAGAGTAGGTGCTTCTTCCAAGC) y 3970tagR (GATCGGATCCCCGGAAGAGCACTAAGATCC) y se clonó en construcciones de etiquetado 6 x myc o GFP pNATTAGx; Se utilizaron versiones con un marcador seleccionable de blasticidina105. Se confirmó el ensamblaje correcto mediante secuenciación y estas construcciones se linealizaron con SalI antes de la transfección.

Las células granuladas se lisaron en tampón RIPA con ciclos de sonicación de 8 x 5 s a una amplitud de 5 µm en un desintegrador ultrasónico (MSE) Soniprep 150 con un generador de 23 kHz y se centrifugaron a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima. Las proteínas del sobrenadante se separaron mediante SDS-PAGE y procedimientos de transferencia estándar. La detección de proteínas se logró utilizando el clon 9B11 del anticuerpo primario α-myc de ratón (1:5000) o el anticuerpo primario α-EF1α de ratón (Millipore, 1:20,000) con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante de α-ratón de cabra (Biorad, 1:2000). Las transferencias se desarrollaron utilizando el kit de quimioluminiscencia mejorada (Amersham) según las instrucciones del fabricante.

Las células se fijaron en paraformaldehído al 1% y se unieron a portaobjetos de 5 mm de 12 pocillos (Thermo Scientific) secándolos durante la noche. Después de la rehidratación en PBS durante 5 minutos, las células se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,5% durante 15 minutos y se lavaron 3 veces en PBS. Los portaobjetos se bloquearon con FBS al 50% en PBS durante 15 minutos y se lavaron en PBS dos veces. Los portaobjetos se incubaron primero con anticuerpo primario de conejo α-GFP (Abcam, 1:250) y luego con anticuerpo secundario de conejo α Alexa 488 (1:2000) durante 1 h cada uno, seguido de 3 lavados en PBS. Finalmente, los portaobjetos se montaron en Vectashield con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) y se sellaron bajo un cubreobjetos antes de tomar las imágenes. Para la tinción solo con DAPI, los portaobjetos se montaron directamente en Vectashield con DAPI después de la rehidratación. Se tomaron imágenes de las células con un aumento de 63x con inmersión en aceite bajo un microscopio Zeiss Axiovert 200 M con software Zen Pro (Zeiss). La visualización y cuantificación de DAPI y GFP se realizaron en ImageJ (Fiji) v1.53q. Para la cuantificación de la intensidad de la señal, las partículas se definieron automáticamente a partir de una imagen binaria del canal DAPI y luego las partículas del cinetoplasto y del núcleo se distinguieron manualmente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de alto rendimiento generados en este estudio se han depositado en Short Read Archive (SRA) con el código de acceso PRJNA641153. Los datos mapeados se pueden visualizar utilizando una herramienta en línea en https://tryp-cycle.pages.dev/. Se pueden encontrar más datos relacionados con genes individuales en tritrypdb.org. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código para el análisis de datos RIT-seq114 (https://zenodo.org/record/7002689) y para la herramienta de visualización en línea115 (https://zenodo.org/record/7002687) están disponibles en GitHub.

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Descargar referencias

Agradecemos a R. Clark, A. Rennie y M. Lee de Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, que cuenta con el apoyo de Wellcome Trust (097418/Z/11/Z). También agradecemos a L. Glover por sus consejos sobre la manipulación de bibliotecas de ARNi, a S. Hutchinson por sus consejos sobre el análisis de datos RIT-seq y a J. Faria y G. Bravo Ruiz por sus fructíferos debates. El trabajo fue financiado por los premios Wellcome Trust Investigator Awards [100320/Z/12/Z y 217105/Z/19/Z para DH]. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos, ni en la decisión de enviar el trabajo para su publicación.

Catarina A. Marques

Dirección actual: Centro Wellcome de Parasitología Integrativa, Universidad de Glasgow, 120 University Place, Glasgow, G12 8TA, Reino Unido

Estos autores contribuyeron igualmente: Catarina A. Marques, Melanie Ridgway, Michele Tinti.

Centro Wellcome para la Investigación Antiinfecciosa, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH, Reino Unido

Catarina A. Marques, Melanie Ridgway, Michele Tinti y David Horn

Centro Tayside de Análisis Genómico, Hospital y Facultad de Medicina Ninewells, Dundee, DD1 9SY, Reino Unido

andres cassidy

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CAM, MR, AC y DH diseñaron los experimentos. CAM y MR realizaron los experimentos. CAM, MR, MT y DH analizaron datos experimentales. MT realizó la curación y visualización de datos. DH supervisó el proyecto y obtuvo financiación. CAM, MR, MT y DH escribieron el manuscrito.

Correspondencia a David Horn.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Marques, CA, Ridgway, M., Tinti, M. et al. Perfil de interferencia de ARN a escala genómica de los defectos de progresión del ciclo celular de Trypanosoma brucei. Nat Comuna 13, 5326 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33109-y

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Recibido: 05 de mayo de 2022

Aceptado: 31 de agosto de 2022

Publicado: 10 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33109-y

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